폐렴의 진단이 이용되는 검체는 주로 하기도 검체이며, 이 중에서도 객담은 폐렴 진단에 가장 많이 이용되는 임상 검체이다. 아침 일찍 식사 전 입안을 헹구고 깊은 기침으로 받는다. 수돗물로 헹굴 시 mycobacteria 배양에서 nontuberculous mycobacteria에 의한 오염이 생길 수 있다[8]. 환자가 콧물이나 타액을 뱉지 않도록 한다. 검체는 채취 즉시 검사실로 운반하여야 하며, 운송 지연이 예상될 경우 냉장 보관한다. 기관 절개 환자에서는 기관내튜브(endotracheal tube) 흡인액이 이용될 수 있으며 trap 장치와 같은 용기를 이용하여 채취한다(Fig. 1). 채취가 끝난 trap 튜브의 말단만 막아 운송하는 경우는 검체 유출이 흔하므로 검체 뚜껑은 스크류캡으로 바꾸어 밀봉한다. 기계환기를 위해 삽관된 환자에서는 기관 내 흡인액(endotracheal aspirates, ETAs)을 이용할 수 있으나 ETAs를 이용한 배양에서 발견되는 균은 튜브내 생성된 biofilm으로 인해 집락화된 균과 병원체를 구별하기 어렵다는 의견이 있다[9,10]. 이에 ETAs와 기관지에 보다 더 가깝게 접근할 수 있는 기관내 튜브 검체(endotracheal tube specimens, ETTs)를 비교하여 어느 것이 더 적절한 검체인지 평가한 연구들에서는 두 검체 간 유의한 차이를 발견하지 않아 접근성에서 우수한 ETAs의 사용을 추천하였다[10].

모든 객담은 질 평가를 위해 그람 염색이 시행된다. 상피세포가 적고 백혈구가 많을수록 고품질의 객담으로 평가되며, 현미경을 이용한 검경에서 100배 시야당 상피세포가 25개 이상 관찰되면 배양에 부적합한 것으로 판단한다[11]. M. tuberculosis나 L. pneumophila는 정상 균무리가 아니므로 이들이 검사 목적인 경우는 객담의 질과 관계없이 염색과 배양이 진행된다. 현대 검사실에서는 최첨단 핵산 분석 기술이 이용되고 있지만 전통적인 그람 염색을 고품질의 객담으로 시행한 경우 지역사회획득폐렴 환자에서 낮은 비용으로 치료를 결정할 수 있는 중요한 정보를 얻을 수 있다. Ogawa 등[12]은 메타분석에서 객담의 품질과 관계없이 모든 검체를 대상으로 했을 때 36% (95% credible interval [CrI], 22%-53%)에서만 원인 병원체가 확인된 반면, 좋은 품질의 객담에서는 73% (CrI, 26%-96%)에서 치료 대상 병원체가 식별된다고 보고하였다.

검사실에 의뢰된 검체는 통상 세가지 증균배지(blood agar plate, chocolate agar plate, MacConkey agar plate)에 접종한다. L. pneumophila와 같은 경우는 특수한 배지가 필요하므로 의심되는 경우 별도로 검사실에 전달하여야 적합한 선택배지에 접종된다. 호흡기 검체 배양에서 자라는 모든 병원체가 최종 결과로 보고되는 것은 아니다. 결과를 배양된 그대로 보고할 경우 불필요한 항균제 사용을 유발할 수 있다[13]. 임상의가 가장 흔히 보게 되는 결과는 ‘상기도 정상균 무리’ 또는 ‘Mixed gram positive/negative organisms’과 같을 것이다. 이는 배지 상에서 여러 가지 미생물이 섞여 자라는 것으로, 구강 및 상부 호흡기 상재균과 병원균을 구별하기 어려운 경우이다. 이러한 결과는 검체가 구강의 타액에 가깝다는 의미로 하기도의 미생물 상태를 반영할 수 있는 검체로 보기 어렵다는 것으로 해석할 수 있다[14]. 정확한 진단을 위해서는 객담 등의 하기도 검체를 다시 받아 검사를 의뢰한다. 불필요한 항균제 사용을 줄이기 위한 이유로 상기도의 혐기성 정상균 무리를 포함하는 객담으로는 혐기성 배양이 시행되지 않는다. 병원성이 높은 균이 자란 경우에는 다른 세균과 섞여 자라더라도 보고된다(e.g. Streptococcus pyogenes) [14]. 배양 결과 음성은 하기도 감염을 배제하지 않는다. 배양 위음성은 지연된 검체 운송, 항균제 투여 후 검체 채취, 일반적인 증균배지에서 자라지 않는 세균, 진균, 바이러스 또는 기생충이 원인인 경우가 있다[1,15].

배양된 세균의 동정에는 용혈성, 혈청형, 생화학 반응 및 말디토프 질량분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) 등이 이용된다. 혈청학적 동정의 대표적인 예는 β-hemolytic streptococci의 동정에 사용되는 Lancefiled grouping이 있다[16]. 이는 호흡기 감염의 주요 원인균인 catalase 음성 그람양성구균의 동정에 쓰이는 것으로 세포벽의 carbohydrate를 항원으로 하는 응집반응을 이용하여 그룹 A, B, C 등으로 분류한다[17]. 이 방법은 1930년대부터 사용된 오래된 동정법이나 종(species) 수준으로 신속한 동정이 가능한 오늘날에도 임상에서는 여전히 과거의 혈청형으로 균을 지칭하는 경우가 흔하다. Group A streptococcus (GAS, S. pyogenes)과 group B streptococcus (GBS, S. agalactiae)가 대표적이다[18]. 진균의 경우 Candida와 같은 yeast는 생화학 동정이나 MALDI-TOF MS로 쉽게 동정되나 사상형 진균은 현미경을 이용한 형태학적 동정을 주로 이용하고 있다.

MALDI-TOF MS는 임상검체에서 분리되는 대부분의 세균을 생화학 반응을 이용한 동정법보다 더 신속하고 정확하게 동정할 수 있다[19]. 그러나 폐렴 원인균 중에는 MALDI-TOF MS로도 종간 구별이 어려운 균 집단이 있다. 호흡기 검체에서는 A. baumannii, A. nosocomialis 그리고 A. pittii 등이 포함되어 있는 A. baumannii-calcoaceticus complex (ABC)가 그들 중 하나이다[20]. Multidrug-resistant A. baumannii (MRAB)가 분리된 환자에게는 별도의 감염관리가 필요하나 ABC 내 종(species)간 구별이 분명하지 않을 경우 현장에 혼돈을 줄 가능성이 있다. MALDI-TOF MS 제조사들은 균의 동정에 사용되는 스펙트럼 정보를 담은 라이브러리와 알고리즘을 개선하는 등 동정 성능을 향상시켜 이 문제를 해결해 나가고 있다[20,21].

항원 검사는 배양보다 신속한 결과로 진료에 도움을 줄 수 있다. 신속 항원 검사에는 측면유동면역발색법(Lateral flow immunochromatographic assay, LFIA)이 이용되어 보다 빠르고 정확한 진단을 가능하게 한다. LFIA 에서 검출대상 항원의 존재를 시각화 하는 데 사용되는 표지자에는 colloidal gold가 대표적이다[22]. 보다 검출 민감도를 높이기 위하여 형광표지자를 이용하는 유로퓸(Europium)이 이용 되었고 최근에는 Quantum dot을 이용한 검사도 폐렴 원인 병원체 검출을 위해 개발 되었다[23]. Quantum dot은 발광 안정성이 높고 크기와 형태를 조절하여 발광하는 색을 조절할 수 있으므로 다중 타겟을 동시에 검출할 수 있는 다색(multicolor) 검출에 응용이 가능하다[24]. Quantum dot 기반 항원 검출 LFIA는 인플루엔자바이러스(influenza virus) 및 사스 코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)를 대상으로 개발되어 향상된 민감도를 보여 주었다[23,24].

폐렴의 진단에 사용되는 소변 항원검사는 L. pneumophila와 S. pneumoniae 두 가지를 대상으로 시행된다[25]. 소변 항원검사는 검체를 얻기 쉽고 현장검사(point-of-care testing, POCT) 형태로 간편하고 신속하게 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 그러나 항원검사 결과가 음성이더라도 감염을 배제할 수 없다. Legionella는 현재까지 65종이 알려져 있고, 그 중 사람에서 감염과 관련이 있는 것으로 보고된 것은 30여 종이 있으며, 이 중 L. pneumophila가 전체 감염의 80%-90%를 차지한다[26,27]. L. pneumophila에는 혈청군이 16개가 있는데 이 중 소변 항원검사는 혈청군 1만을 대상으로 한다. 그 이유는 혈청군 1이 인체 감염의 대부분을 차지하기 때문이다. 그러나 혈청군 1 이외의 혈청형에 의한 감염의 비율은 연구 그룹마다 9%-40% 수준으로 넓은 범위로 보고 되고 있다[28]. 질병관리청에서 레지오넬라증 의심 환자의 혈청을 이용하여 혈청군 1-15에 대한 항체 조사 결과도 한국에서 다양한 혈청군에 의한 감염 가능성을 시사하였다[29,30]. L. pneumophila 혈청군 1에 의한 감염이 확인된 환자의 소변을 대상으로 한 연구들에서 Legionella 소변 항원검사의 민감도는 55%-80% 수준으로 보고되고 있어 임상적으로 레지오넬라증이 의심되는 경우 항원검사 결과가 음성인 경우는 위음성의 가능성을 고려해야 한다[31].

S. pneumoniae 폐렴의 경우 혈액배양과 객담배양의 민감도는 각각 30% 및 57% 미만으로 보고되었다[32]. 그러나 소변 중 pneumonococcal C-polysaccharide coat protein를 colloidal gold를 이용하여 검출하는 항원검사 중 하나인 BinaxNow S. pneumoniae urinary Antigen Card (Abbott, Lake County, IL, USA)에 대하여 27개의 연구로 메타분석한 연구에서 민감도와 특이도는 각각 74% 및 97%로 나타나 지역사회획득폐렴 의심환자에서 보다 신속하고 유용하게 이용할 수 있다고 보고하였다[32]. 그러나 소아에서는 상기도 상재균으로 존재하는 비율이 성인보다 높아 건강한 소아의 소변의 약 8%에서 양성반응을 보일 수 있으므로 상기도에서 S. pneumoniae의 집락화 비율이 낮은 집단에서 소변항원검사가 폐렴 진단에 유용할 것이라는 의견이 있다[33]. 한국에서 생후 6개월에서 71개월 사이의 소아 1,406명을 대상으로 한 조사에서 S. pneumoniae의 비강내 집락화 비율은 36.4%-42.1%로 보고 되었다[34].

바이러스성 폐렴 진단에는 PCR 기반 진단 검사가 유용하다[35]. 배양이 기본검사로 시행되는 세균과 달리 바이러스 배양은 숙주세포주 관리가 까다롭고, 대유행을 일으킨 일부 인플루엔자바이러스와 코로나바이러스는 3급 생물학적 안전시설이 필요하며, 배양된 바이러스를 확인하는 과정 또한 여러 단계를 거치므로 신속한 결과 보고에는 기술적으로 많은 제약이 따른다[36]. 이러한 이유로 상기도 및 하기도 감염에서 PCR은 병원체 검출에 널리 이용되고 있는데, 특히 다양한 바이러스를 세균과 함께 한번에 검출하기 위한 syndromic multiplex PCR은 원인 병원체가 달라도 증상은 유사한 폐렴, 특히 중증 지역사회획득폐렴(severe CAP)에서 이용이 권장된다[37,38]. 통상 하기도 검체 배양에 사용되는 배지에서 자라지 않는 비정형 폐렴 원인 세균들(e.g. Mycoplasma spp., Chlamydia spp.)의 검출에도 multiplex PCR이 이용된다[39].

국내에서는 범용 PCR 장비를 이용하는 키트 형태의 제품과 전자동화된 신속 검사 두 가지 형태 모두 사용되고 있다. 범용 PCR 장비를 이용한 검사 과정은 검체에서 핵산 추출, 증폭, 검출 과정을 따로 진행하여 수작업에 소요되는 시간이 대략 4-6시간 정도이다. 검사실에서 검체를 모아 검사를 일괄 처리 방식(batch)으로 시행하는 경우 검사 의뢰 후 결과를 받아 보기까지 1-3일 가량의 시간이 필요하다. 보다 신속한 분자진단 결과를 제공하기 위해 현장진단 개념의 분자진단법이 개발되어 임상 현장에 보급되었다. 신속 분자진단의 기술적 진보는 마이크로 유체역학(microfluidics) 기술의 도움을 많이 받았다[40]. 이 기술은 아주 소량의 액체를 정밀하게 조작할 수 있으며, 핵산의 추출, 증폭, 그리고 검출 과정을 자동화할 수 있도록 하였다. Real time PCR이나 multiplexed nested PCR을 이용하는 신속분자진단은 검사에 약 45분 정도가 소요된다. 한편, 증폭 시간을 줄이기 위해 Loop-Mediated Isothermal Amplification 방법을 이용하여 검사 시간을 30분 이하로 단축한 검사법도 개발 되었다[41].

전자동화 신속 PCR의 경우 검체가 검사실에 도착 즉시 개별 검사가 시행될 수 있도록 검체 하나의 PCR에 필요한 시약과 소모품이 카트리지 형식으로 구성되어 있다. 신속 syndromic multiplex PCR 제품 중 하나인 Biofire Filmarray pneumonia panel (FA-PP; bioMérieux, Marcy-l’Étoile, France)의 경우는 세균 및 바이러스를 한번에 검출함과 동시에 항균제 내성 유전자를 포함한 33개의 유전자 표적을 검출할 수 있으며, 배양과 비교 시 더 많은 병원체를 검출한다고 보고되고 있다[42,43]. 배양에서 반정량으로 보고되는 세균에 대해서는 FA-PP도 반정량으로 결과를 보고 하나 배양 결과와는 다소 차이가 있다. 국내에서 수행된 한 연구에서는 FA-PP의 반정량 결과와 객담 배양 결과 간의 일치율은 샘플 내의 세균 농도에 따라 다르며, FA-PP에서 세균 농도가 10⁷ copy/mL로 높은 경우 배양 결과 간의 일치율은 76.9%인 반면 10^4-6 copy/mL로 낮을 경우에는 객담의 질과 무관하게 8.6%로 낮게 보고 되었다[44]. FA-PP 및 PCR에서 검출되는 병원체는 현재 감염의 원인 병원체가 아닌 최근의 감염에서 유래한 것일 수 있어 PCR검사 결과 단독으로 폐렴을 진단하거나 원인균을 특정하는 것은 어려운 경우가 있다[6]. 또한 세균과 바이러스가 동시에 검출되는 경우가 흔하여 결과를 해석하는 주의가 필요하다. 영국에서 323명 이상의 지역사회획득폐렴 환자를 조사한 연구에 따르면 하기도 검체에서 호흡기 바이러스가 검출된 30% 환자 중 바이러스만 검출되는 경우는 5.6%에 그쳤다[45]. 또한 이들 검사가 불필요한 항균제 사용을 줄이는데 유용한지는 연구자마다 다양한 결과를 보고하였다. 미국에서 124명의 중환자실 환자를 대상으로 수행한 연구에서는 syndromic multiplex PCR의 사용이 항균제 사용 중단에 기여하였는지는 통계적으로 유의하지 않았다고 보고하였다[46]. 한편 multiplex viral panel에 대하여 25개의 연구를 대상으로 한 메타분석에서는 방사선 소견, procalcitonin의 활용, 7시간 이내의 신속한 결과 보고와 함께 적극적 항균제 스튜어드십을 수행한 경우 항균제 또는 항바이러스제의 사용을 줄이는 데 기여하였다고 보고하여 신속진단검사, 영상학적 검사와 함께 전문가의 적극적인 중재가 필요함을 시사하였다[47]. 마찬가지로 폐렴의 진단과 치료 결정에 syndromic multiplex PCR test의 사용이 환자의 생존율 향상에 기여할 수 있는지에 대한 관심이 높아지고 있다. 혈류감염에서는 syndromic multiplex PCR 검사의 사용이 생존율 향상과 관련이 있었다는 보고가 있다[38]. 폐렴에 대해서는 입원일 감축 또는 생존율의 향상과 관련이 있는지 알아보기 위한 임상시험이 진행되고 있다[48].

차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing, NGS)은 기존의 Sanger sequencing이 한번의 전기영동에서 700-800개의 염기 서열만 분석이 가능했던 한계를 극복하여 메가베이스에서 기가베이스 용량의 염기서열 분석이 가능하다. 의료분야에서 NGS는 사람의 조직적합성 분석 또는 암 유전자 분석에 도입되어 활발히 이용되고 있다. NGS가 기초과학 및 임상 분야에 처음 도입된지 약 20년이 지나 대중화된 지금 시점에서는 차세대라는 용어 보다는 대용량 염기서열 분석(High Throughput Sequencing, HTS)이라는 표현이 더 적합하나 처음 연구자들 사이에서 통용되었던 NGS라는 명칭이 지금도 사용되고 있다[49]. 감염 분야에서 NGS의 활용은 연구 분야에서 주로 이루어지고 있으며 신종 미생물의 확인이나 미생물군집의 지놈(Genome) 분석 연구에 이용되고 있다[50]. NGS를 이용한 전장 유전체 염기서열 분석(whole genome sequencing)은 감염 원인 병원체를 알 수 없는 신종 감염병을 조사할 때 유용하다. 실제로 2019년 원인 불명의 폐렴 환자에서 SARS-CoV-2를 최초로 확인할 때도 NGS가 사용되었다[51]. 병원체의 전체 지놈을 분석 대상으로 하므로 병원체의 동정 및 분류학적 확인 뿐만 아니라 약물 내성 유전자, 전파 경로를 계통학적으로 파악하여 역학 조사에도 활용이 가능하다[50]. NGS에서 얻은 염기서열 정보를 미생물학적으로 해독하고 분석하기 위해서는 수학, 통계학, 프로그래밍 등을 활용한 생물정보학(bioinformatics)에 기반한 데이터 가공이 필요하다.

마이크로바이옴(microbiome)은 생물체나 환경에 존재하는 다양한 미생물군과 그 환경의 총합을 의미하며 미생물 지놈의 총합이라는 메타지놈(metagenome)과 유사한 개념으로도 쓰인다. 유사한 용어로 microbiota는 미생물의 총합을 의미한다[52]. 마이크로바이옴 분석은 인체에서 미생물이 가장 풍부한 장(gut)을 대상으로 연구가 많이 수행되었으며 호흡기에 대해서는 다른 장기와 함께 그 뒤를 잇고 있다. 하부 기도는 구강과 해부학적으로 연속되어 있고 정상적으로 미생물군이 존재하므로 폐렴에서 호흡기 마이크로바이옴의 변화가 동반될 것이라는 가설에 따라 폐렴에서 마이크로바이옴의 특징과 임상적 의미에 대한 연구가 활발히 진행 중이다[53].

마이크로바이옴을 연구하는 방법은 과거 배양에 의존하였으나 각 미생물이 성장하는 조건을 모두 맞추기는 현실적으로 불가능하였다. 한편 NGS는 배양 여부에 관계없이 원검체에서 모든 미생물의 지놈을 분석할 수 있으므로 이론적으로는 편향 없는(unbiased) 분석이 가능하다[54]. 또한 NGS 장비의 대중화로 인해 분석 가격이 하락하여 대량의 검체를 대상으로 한 연구도 가능하게 되었다. NGS를 이용한 마이크로바이옴 분석 방법은 크게 두 가지로 나뉜다. 하나는 세균이나 진균의 특정 표지 유전자(16s rRNA genes, 18s rRNA genes 혹은 다른 유전자)만을 분석 대상으로 하는 amplicon sequencing (Fig. 2A), 또 다른 하나는 검체 내 포함된 모든 핵산을 분석 대상으로 하는 shotgun sequencing이 있다(Fig. 2B). 임상 검체를 이용하여 shotgun sequencing을 시행하는 경우 사람의 지놈까지 함께 염기서열 분석이 이루어지게 된다. 이는 분석된 지놈에서 미생물 지놈의 비율을 낮추어 미생물 유전자에 대한 검출 민감도를 낮추는 결과를 초래하는 단점이 되기도 하나, 사람의 지놈을 동시에 분석하면 감염에 따른 숙주 반응을 연구할 수 있는 장점이 되기도 한다. 지금까지 보고된 shotgun sequencing을 이용한 임상 연구들에 따르면, 대변을 이용한 장내 미생물 분석에서 얻은 염기 정보의 대부분은 미생물의 지놈인 것과 달리 기관지폐포세척액을 대상으로 한 경우에 얻은 염기서열정보의 99% 이상이 인간 지놈(host genome)인 것으로 보고되었다[55]. 이처럼 낮은 미생물 지놈 비율은 극히 일부분의 염기서열 정보만으로 미생물 정보를 추출해야 하는 기술적 어려움을 의미한다. 이를 극복하기 위하여 염기서열 분석 전 검체에서 사람의 지놈을 제거 또는 미생물 핵산의 선택적 농축과 같은 기술 개발이 시도되고 있다[56,57]. 폐렴 환자의 호흡기 검체를 대상으로 한 연구들은 공통적으로 세균에 의한 폐렴에서는 원인균의 지놈이 우세하게 발견되며 미생물 군집의 다양성이 건강대조군 대비 감소한다고 보고하였다[58,59]. 그러나 지놈의 크기가 작은 바이러스에 대해서는 보고된 연구 결과가 매우 적으며, 검출 한계도 기존의 PCR에 상응하지 못한 것으로 보고 되고 있다[60].