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서 론
FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3)는 조혈모세포에서 증식을 촉진하고, 분화를 억제하며 세포 생존을 증가시키는 다중 세포 신호 전달 경로의 상류에 존재하는 유전자이다. FLT3 돌연변이는 막 근방 도메인을 코딩하는 엑손 14 및 15에서 주로 발생하며 3-400개의 염기서열 중복으로 발생하는 internal tandem duplication (ITD)이 가장 흔하여 성인 급성골수백혈병(acute myeloid leukemia, AML) 환자의 20-30%에서 관찰된다[1]. FLT3 돌연변이가 존재하면 정상적인 인산화 자동억제조절기능을 상실하게 되고 지속적인 인산화를 유발하여 RAS, MAPK 및 STAT5 신호체계가 활성화되어 백혈병을 유발하게 된다[2]. 여러 연구를 통해 FLT3-ITD는 AML의 불량한 예후인자로 알려져 있다[3-5]. FLT3-ITD는 NPM1 변이와 함께 예후를 예측하는 중요한 분자유전학적인자로 FLT3-ITD 변이 없이 NPM1 변이 양성인 경우 좋은 예후를 보이지만 FLT3-ITD 및 NPM1 변이가 동시에 양성인 경우 FLT3-ITD 변이의 대립유전자 비율(allelic ratio, AR)에 따라 예후는 차이를 보인다[3, 4, 6, 7]. 2017년 European LeukemiaNet (ELN) 가이드라인에서 FLT3-ITD 변이가 양성이라도 낮은 AR (<0.5)을 보이면서 NPM1 양성인 경우 높은 FLT3-ITD AR (>0.5)을 가진 환자보다 좋은 예후를 보이며 이 경우 동종조혈모세포이식을 고려하지 않아도 된다고 하였다[8]. 그러나 이후 연구에서 FLT3-ITD 양성 AML 환자에서 첫 번째 완전 관해 후 동종조혈모세포이식을 받는 것이 FLT3-ITD AR에 관계없이 예후를 향상시키는 것으로 보고하였다[9]. 이후 2019년 National Comprehensive Cancer Network (NCCN) 가이드라인에서 ELN 가이드라인을 받아들여 AML 진단 시 FLT3-ITD 변이 및 FLT3-ITD AR 평가를 필수적으로 시행할 것을 제안하였다[10].
FLT3-ITD 돌연변이는 중합효소연쇄반응 후 전기영동, 직접염기서열분석법, 절편분석법, 차세대염기서열분석법 등을 통해 검출 가능하며 FLT3-ITD AR은 주로 절편분석법을 이용하여 계산한다[11]. 하지만 검사 방법마다 분석적 성능이 다르며, AR의 계산방법이나 보고 양식 또한 각 검사실에서 자체적으로 설정한 방법에 따라 다양하게 이루어지고 있는 실정이다. 이에 본 연구에서는 FLT3-ITD 검사의 국내 현황을 파악하고, 본 검사에 대한 학회원들의 의견을 수렴하여 추후 FLT3-ITD AR 정량 분석의 표준화를 위한 기초자료로 사용하고자 설문조사를 시행하고 응답자의 답변을 분석하였다.
재료 및 방법
연구자는 2021년 기준 대한진단검사의학회 회원 중 대학병원 및 3차 의료기관의 검사실 책임자에게 대표로 설문을 보내고 참여 의사를 확인한 후 답변에 응한 24기관의 답변을 분석하였다.
설문 항목은 기관의 FLT3-ITD 검사 현황(4문항), 검출한계 및 정량한계 검증(1문항), 내·외부 정도관리 방법(3문항), 결과보고(3문항) 및 검사에 대한 기관의 의견(1문항)에 대한 평가로 총 12문항으로 이루어졌다. 각 문항별 설문 응답 빈도를 분석하였고, 주관식 질문의 경우 별도로 기술하였다.
결 과
설문에 회신한 24기관은 모두 FLT3-ITD 검사를 원내 혹은 외부위탁으로 시행하고 있다고 답하였다. 자세한 설문 내용은 Table 1에 정리하였다.
1. FLT3-ITD 검사의 현황
FLT3-ITD 검사를 원내에서 시행하고 있는 기관 37.5% (9/24), 외부위탁하는 기관 41.7% (10/24), 원내 및 원외 검사를 병행하는 기관 20.8% (5/24)이었다(Table 2). 검사 방법은 절편분석법(PCR & fragment analysis), 직접염기서열분석법(PCR & direct sequencing), 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 세 가지 중 중복 선택이 가능하였는데 절편분석법이 87.5% (21/24)로 가장 많이 이용되었고 NGS법 54.2% (13/24), 직접염기서열분석법 29.2% (7/24) 순이었다. FLT3-ITD 검사를 두 가지 방법으로 시행하는 기관이 62.5% (15/24)로 가장 많았으며, 한 가지 검사법만 시행하는 기관은 33.3% (8/24), 절편분석법, 직접염기서열분석법 및 NGS법 세 가지를 모두 시행하는 기관은 1기관(4.2%)이었다. 한 가지 검사법만 시행하는 경우 절편분석법 시행 기관 25.0% (6/24), 직접염기서열분석법 시행 기관 8.3% (2/24)였으며 NGS법만 단독으로 검사하는 기관은 없었다. 두 가지 검사법을 시행하는 경우 절편분석법과 NGS법을 병행하는 곳이 45.8% (11/24)로 가장 많았으며 절편분석법과 직접염기서열분석을 병행하는 곳이 12.5% (3/24), 직접염기서열분석과 NGS법을 병행하는 곳은 1기관(4.2%)이었다.
검사방법을 두 가지 이상 시행하는 이유에 대해 주관식으로 질문하였고 결과는 다음과 같았다. 절편분석법과 NGS법을 둘 다 시행하는 이유로 결과보고시간 단축을 위해(5기관), 정확한 정량 검사를 위해(4기관), 검사 방법 간 민감도의 차이 때문(4기관), 혈액암 NGS 패널검사 및 절편분석법을 병행하여 검사하기 때문(2기관), AML 추적 관찰 시 정량 검사를 위해(1기관)라고 답하였다. 절편분석법과 직접염기서열분석을 같이 시행하는 이유는 정성 및 정량 검사를 모두 시행하기 위한 목적(3기관)이었으며, 직접염기서열분석과 NGS법을 같이 시행하는 1기관은 혈액암 NGS 패널검사를 시행하지 않는 경우 직접염기서열분석법으로 FLT3-ITD 검사를 시행한다고 하였다.
FLT3-ITD AR 정량 분석 방법에 대한 질문에서 9기관은 검사실자체개발방법에 의한 절편분석법을 이용 중이었으며 3기관에서 NGS 포획(capture)법으로 시행한다고 답하였다.
FLT3-ITD AR 정량 분석의 검사 시기에 대해서는 진단 및 추적 검사 시 모두 시행하는 기관이 60% (9/15), 진단 시에만 시행하는 기관이 40% (6/15)였다. 추적 검사 시행 시기를 주관식으로 질문하였는데 치료 후 골수 검사 시행할 때마다 시행(4기관), AML 재발 시 시행(2기관)한다고 하였으며, 1기관은 관해유도요법 후, 공고 요법 후, 골수이식 전/후에 모두 시행한다고 답하였다.
2. FLT3-ITD 정량 검사의 검출한계 및 정량한계 검증
FLT3-ITD AR 정량 분석 검사의 수행능 검증을 위한 검사실자체개발검사의 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ) 검증 유무에 대한 질문에서 LOD 및 LOQ 모두 검증값이 있는 기관은 없었다. LOD만 검증한 기관이 55.6% (5/9)였으며 각 기관별 LOD 검증값은 0.1%, 1%, 3%, 5% 및 mutant type별 32 bp, 66 bp, 100 bp 각각 2.78%, 5.15%, 3.46%로 다양하였다.
3. FLT3-ITD 검사의 내·외부 정도관리 현황
FLT3-ITD 검사의 내부정도관리 시행 기관은 88.9% (8/9)였으며 내부정도관리 시행방법에 대해서는 매 검사 시 양성 및 음성 검체를 이용(3기관), 매 검사 시 양성 검체 혹은 음성 검체를 이용(각각 1기관), 매 검사 시 음성 검체 이용하고 양성 검체는 5검체당 1회 시행(1기관), 분기마다 양성, 음성 검체를 이용(1기관), 매 검사 시 전기영동 band 확인(1기관)한다는 답변이 있었다.
FLT3-ITD AR 정량 분석에 대한 외부정도관리를 시행하는 기관은 없었으며 기관들은 모두 외부정도관리에 FLT3-ITD AR 정량 분석을 추가 시 참여할 의사가 있다고 답하였다. 원내에서 검사 시행중인 9기관들은 모두 유전자검사평가원 및 대한임상검사정도관리협회 신빙도조사의 FLT3-ITD 정성검사 외부정도관리에 참여하고 있었으며 3기관은 추가로 The College of American Pathologists (CAP) survey에 참여하고 있었다.
4. FLT3-ITD 정량 검사의 결과보고 및 기타 의견
FLT3-ITD 검사의 적절한 검사소요시간(turnaround time, TAT)은 7일 이내라고 답변한 기관이 36.8% (7/19), 10일 31.6% (6/19), 15일 21.1% (4/19) 순이었으며 1-2일 및 30일 이내로 답한 기관도 각각 한 기관 있었다.
FLT3-ITD 정량 검사 결과값인 AR을 보고하는 기관은 37.5% (9/24) 이었다. FLT3-ITD 양성인 경우 결과보고 양식은 AR (mutant/wild type ratio)로 기술하는 기관 77.8% (7/9), AR (mutant/wild type ratio) 및 mutant length를 기술하는 기관 22.2% (2/9)이었다. AR을 FLT3-ITD peak area/FLT3-wild type peak area로 계산하는 기관이 88.9% (8/9)로 대부분이었으며 1기관은 FLT3-ITD peak height/FLT3-wild type height로 계산하였다.
주관식 질문으로 FLT3-ITD AR 정량 검사 관련 건의사항을 요청하였는데 절편분석법을 통해 산출되는 AR이 절대적인 정량값이 아니기 때문에 FLT3-ITD 정량검사라는 검사명을 쓰는 것에 우려를 표시하는 의견이 있었다.
고 찰
FLT3-ITD 검사 시행기관의 현재 상황을 본 설문을 통해 확인하였다. FLT3-ITD 돌연변이 유무 확인 및 AR 분석을 위해 대부분의 기관(87.5%)에서 절편분석법을 사용 중이었으며, NGS법을 시행하더라도 90% 이상의 기관에서 절편분석법을 같이 시행하고 있었다. 또한 FLT3-ITD 검사는 AML 진단 시 예후 예측 및 치료 결정뿐만 아니라 치료 후 추적 검사의 목적으로도 이용되고 있는 것을 확인하였다.
AML에서 FLT3-ITD 돌연변이 유무의 확인 외에 추가적인 AR 확인은 예후 예측및 추적관찰에 중요하다. ELN과 NCCN 가이드라인에서는 정상 대립유전자 대비 돌연변이 대립유전자 비율이 0.5 초과인 경우 고위험군으로 분류하고 있으며[8, 10], 추적관찰 시 AR 확인은 미세잔존질환의 모니터링에 유용하게 이용된다[11, 12]. 국내에서 FLT3-ITD AR 정량 분석은 전체 응답한 기관 중 70.8% (17/24기관)에서 시행하고 있었으며 원내에서 검사하는 9기관 모두 절편 분석법을 이용하고 있었다. 절편분석법은 1-5%의 민감도를 갖는 것으로 알려져 있으며[1], 국내 기관들도 비슷한 수준의 민감도를 검증한 것으로 파악되었다. 하지만 절편분석법은 돌연변이의 길이가 길수록 중합효소연쇄반응의 효율이 낮아져 AR이 실제보다 낮게 측정되는 편향(PCR bias)이 나타날 수 있으며 보정물질(calibrator)을 이용하지 않기 때문에 정확한 정량값이 아니라는 한계점이 있다[7, 13]. NGS법도 적절한 생물정보학 도구(bioinformatics tool)를 이용하는 경우 FLT3-ITD 변이를 잘 검출할 수 있다[14]. 하지만 NGS법으로 측정된 AR은 절편분석법으로 측정된 AR보다 낮게 측정되는 경향성이 있기 때문에, NGS법에서 FLT3-ITD AR을 확인할 때에는 주의가 필요하다[14-16]. 이러한 원인으로는 길이가 긴 FLT3-ITD 돌연변이의 경우, 돌연변이에 대한 해당부위 프로브의 포획 효율이 떨어지는(capture bias) 이유 등이 제시된 바 있으며, 최근에는 이를 보완해서 AR을 측정해주는 생물정보학 도구가 개발되고 있어 추후 NGS법으로도 AR을 정확히 확인할 수 있을 것으로 기대한다[16-18]. 절편분석법과 NGS법의 이러한 검사 한계를 서로 보완하고 보다 정확한 정량검사결과를 얻기 위해 검사실에서는 FLT3-ITD AR 정량 분석 시 하나의 방법을 선택하기보다 두 가지 이상의 방법을 사용하고 있다. 본 설문조사에서도 절편분석법과 NGS법을 같이 사용하는 기관이 다수를 차지하였다. 정확한 정량 결과를 확인하기 위한 목적 외에도 NGS법이 절편분석법에 비해 TAT가 2-4주 정도로 상대적으로 긴 단점을 가지고 있어 실제로 AML 진단 시 예후 판정 및 치료 방향 결정을 위한 FLT3-ITD 검사는 NGS법보다 절편분석법이 주로 선호되고 있다. 설문조사에서 FLT3-ITD 검사의 적절한 TAT에 대해 7-10일로 응답한 기관이 절반 이상을 차지하였는데 NGS법의 임상 활용도 및 검사 건수가 증가한다면 향후 NGS법의 TAT는 점차 줄어들 것으로 생각된다.
AML에서 미세잔존질환의 확인을 위해서는 최소 0.1% 이상의 민감도를 갖는 검사법을 이용해야 한다[19]. 따라서, FLT3-ITD 절편분석법을 이용한 미세잔존질환의 확인에는 한계가 있으며, 높은 커버리지(coverage)의 FLT3-ITD를 표적으로 하는 NGS법을 이용하는 경우 0.1%보다 높은 민감도로 미세잔존질환을 검출할 수 있다[17, 20]. 하지만 현재 국내에서 NGS법을 이용하여 FLT3-ITD 미세잔존질환 검사를 시행하기 위해서는 제도적 보완이 필요한 상황으로, 임상검사로 환자에게 시행되기까지는 많은 시일이 소요될 것으로 생각된다.
설문조사 시 원내에서 FLT3-ITD 검사 시행중인 기관은 모두 국내 외부정도관리에 참여하고 있었으며 FLT3-ITD AR 정량 분석이 정도관리 프로그램에 추가되면 참여의사가 있다고 하였다. 국외 외부정도관리 프로그램 중 하나인 CAP survey의 경우 현재 FLT3-ITD 정성검사항목만 시행 중에 있다. 따라서 유전자검사평가원 및 대한임상정도관리협회에서 FLT3-ITD 정량검사항목의 추가에 대한 논의가 필요할 것으로 생각된다.
본 설문조사 시행 시 일부 주관식 답변을 요구하는 설문의 경우 객관식 문항에 비해 응답률이 떨어지는 한계가 있었다.
이번 설문조사를 통해 국내 검사실의 FLT3-ITD 검사 현황을 파악하고 그 차이를 확인하였다. FLT3-ITD 변이 검출 및 AR 측정은 AML 진단뿐 아니라 치료 후 미세잔존질환 모니터링 시에도 중요성이 증가하고 있다[16]. 검사의 정확성 및 신뢰도를 높일 수 있는 수행능 검증, 검사의 표준화, 외부정도관리가 필요하다. 추가적으로 추적 검사 시행 시기가 각 기관마다 차이를 보여 향후 FLT3-ITD 미세잔존질환 모니터링 시에 추적 검사 시행 시기에 대한 가이드라인 제정도 고려해야 하겠다.
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