Determination of the infection rate of dental caries-causing bacteria in adolescents by a real-time PCR test method

예림 문; 지현 박; 자원 조; 우람 김

doi:10.11149/jkaoh.2020.44.2.73

Abstract

Objectives

The aim of this study was to investigate the infection rates of bacteria associated with dental caries among children and adolescents in Korea.

Methods

Oral examinations were conducted in 146 students. The numbers of bacteria associated with dental caries, such as Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, and Lactobacillus casei, in the subjects’ oral cavity were counted by real-time PCR, and infection rates for those bacteria were additionally investigated.

Results

The infection rate of Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, and Lactobacillus casei was 99.3% (145/146), 63.0% (92/146), 1.4% (2/146), and 25.3% (37/146), respectively. The amounts of Streptococcus sobrinus and Lactobacillus casei did not differ with the participants’ age. However, the number of Streptococcus mutans was 537.6 for primary school students, 5698.2 for middle school students, and 19037.5 for high school students. The mean number of oral bacteria increased with age (P<0.05). The mean bacterial numbers of the infected subjects indicated significant differences in the numbers of Streptococcus mitis and Streptococcus mutans (P<0.05).

Conclusions

The infection rates of Streptococcus mitis and Streptococcus mutans were distinct in children and adolescents. Efforts to control the bacteria associated with dental caries are needed to prevent dental caries.

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서 론

청소년기는 아동기에서 성인기에 이르는 과도기이며, 사춘기와 더불어 신체적, 정서적, 사회적으로 큰 변화가 이루어지는 시기이다¹⁾. 따라서 구강건강을 유지, 증진시키기 위해서는 구강보건 교육시 주의와 관심이 지식으로 이어질 수 있도록 하고, 태도 변화로 이행될 수 있도록 하는 것이 매우 중요하다고 보고된 바 있다²⁾. 그러나 대부분의 청소년들은 구강건강 관리에 관심이 적고, 특히 이 시기는 치아우식에 쉽게 이환 되며 치은염이 시작되는 시기로 매우 중요하다.

치아우식은 구강 내에 가장 흔한 감염성 질환으로써 치면 위에 세균의 의해 형성된 세균막, 즉 치태가 쌓여 발생하는 질환이며³⁾, 복잡한 구강 내에서 구강병이 발생되려면 여러 가지 원인요소가 상호작용 되어야 한다.

치아우식이 발생되는 데 작용하는 요인으로 숙주요인은 치아의 위치, 형태, 성분, 종류와 구강 외 질병, 임신, 유전적 요인과 타액의 양과 성분, 타액의 점조도, 수소이온농도지수(pH)와 완충능력을 포함한다. 병원체 요인으로는 구강 내 산생성균의 종류와 특성 및 양과 활동성, 환경 요인으로는 구강 위생 상태와 구강 위생 관리능력과 식이상태가 포함되고 이러한 숙주 요인, 병원체 요인, 환경 요인의 3가지 요인이 합쳐지는 곳에서 치아우식이 발생되며, Dr. Keye는 이에 시간요인을 추가하여, 어느 정도 시간이 경과하여야만 치아우식이 발생한다고 주장한 바 있다⁴⁾.

이러한 원인 중 병원체 요인인 구강 내 산생성균에 관하여 치아 우식활성검사를 활용하여 향후 치아우식 발생 여부를 예측하고자 하는 노력이 있어 왔으며, Crossner, Zickert, Bretz 등은 타액 내 치아 우식활성검사를 이용하여 우식발생정도를 예측할 수 있다고 보고하였으나^5-7), Tukia-Kulmala와 Tenovuo는 타액의 분비량, 완충력, Lactobacilli와 Streptococcus mutans 수를 측정한 결과에 따르면 개인차에 의하여 치아우식증을 예측하기 위한 목적으로서 효과가 크지 않다⁸⁾고 보고된 바 있다. 그러나 최근에는 구강 세포 내에 발현된 세균들의 정성적인(qualitative) 분석뿐만 아니라 정량적인(quantitative) 분석에 Realtime-PCR법이 이용되고 있으며, 이를 통해 구강 내 치면 세균막이나 타액으로부터 직접 세균을 검출할 수 있게 되어 치아우식 원인균에 대한 다양한 연구가 많이 이루어 지고 있다^9-12).

이에 이번 연구 목적은 유전자 발현의 분석 일환으로 Realtime-PCR 기법을 이용하여 일부 청소년 연령의 치아우식유발세균의 감염률을 측정하여, 향후 치아우식활성검사에서 기존의 배양법에 의한 치아우식유발 산생성세균검사를 대체할 수 있는 유전자검사법에 의한 구강내 치아우식유발세균 검사의 기초자료로 이용하고자 한다.

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연구대상 및 방법

1. 연구대상

이번 연구의 대상자는 2016년 8월부터 2016년 10월까지 연구 참여에 동의한 자 중 남자 72명, 여자 74명 총 146명을 대상으로 하였으며 D대학교 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)로부터 심의 승인을 받아 연구를 실시하였다(D** 2016-08-004).

대상자를 각각 만 8세부터 11세의 초등학생, 만 12세부터 14세의 중학생, 만 15세부터 17세의 고등학생으로 분류하였다(Table 1).

Table 1

Number of subjects by age and gender

Age group	Age (years)	Total	Male	Female
Total		146	72	74
Primary school students	All	21	12	9
	8	3	3	0
	9	5	2	3
	10	1	0	1
	11	12	7	5
Middle school students	All	68	43	25
	12	19	12	7
	13	27	17	10
	14	22	14	8
High school students	All	57	17	40
	15	16	6	10
	16	29	6	23
	17	12	5	7

2. 연구방법

이번 연구에서는 연구에 참여하고자 동의한 만 8세 이상 17세 이하를 대상으로 타액(Saliva)을 채취하여 구강병원성 미생물 DNA 정량분석(Real-time PCR)을 시행하였다.

2.1. 구강미생물검사

구강미생물의 정량분석을 위하여 realtime PCR법을 이용하여 RNA분석을 하는 Easyperio 검사법(YD Life Science Co., Seongnam, Korea)을 이용하였다. Easyperio 검사법은 약 30초간 가글링을 한 용액을 Easy perio kit에 채득하여 분석 의뢰하여 각 미생물의 양을 확인하였다.

2.2. 자료 분석

연구 자료는 Microsoft Excel 2016 (Microsoft Co., Redmond, WA, USA)과 IBM SPSS 23.0 (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 사용하여 대상자의 각각 구강미생물의 수를 분석하였으며, 이때 세균수를 로그지수로 변환하여 양을 분석하였다. 초등학생, 중학생, 고등학생 간의 세균별 미생물수의 비교는 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)을 시행하였으며, 전체 대상자를 대상으로 세균별 상관분석을 실시하였다.

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연구 성적

1. 구강미생물 감염률

구강미생물 감염률은 총 146명 중 Streptococcus mitis는 99.3% (145명)로 나타났으며, Streptococcus mutans는 63.0% (92명), Streptococcus sobrinus는 1.4% (2명), Lactobacillus casei는 25.3% (37명)로 나타났다(Table 2).

Table 2

Prevalence rate of oral microbes

Age group	N	S. mitis	S. mutans	S. sobrinus	L. casei
Total	146	99.3% (145)	63.0% (92)	1.4% (2)	25.3% (37)
Primary school students	21	100.0% (21)	42.9% (9)	4.8% (1)	4.8% (1)
Middle school students	68	100.0% (68)	72.1% (49)	1.5% (1)	22.1% (15)
High school students	57	98.2% (56)	59.6% (34)	0.0% (0)	36.8% (21)

Data are presented as prevalence rate and number of people with bacteria.

2. 연령에 따른 구강미생물의 평균 양

연령에 대한 Streptococcus sobrinus와 Lactobacillus casei는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으나(P>0.05), Streptococcus mitis와 Streptococcus mutans는 유의한 차이를 보였다(P<0.05, Table 3).

Table 3

The amounts of oral microbes in all subject

Microorganism	Age group	N	The amounts of oral microbes

			M	SD	P-value*
S. mitis	All	146	42702.4	49557.9	0.007
	Primary school	21	31257.1^a	39085.5
	Middle school	68	56412.5^a	56326.9
	High school	57	30563.2^a	39879.1
S. mutans	All	146	10163.7	26426.5	0.003
	Primary school	21	537.6^a	1208.7
	Middle school	68	5698.2^ab	10979.5
	High school	57	19037.5^b	39043.4
S. sobrinus	All	146	9.2	99.9	0.058
	Primary school	21	57.1	261.9
	Middle school	68	2.1	17.0
	High school	57	0.0	0.0
L. casei	All	146	231.7	1120.1	0.101
	Primary school	21	1.4	6.5
	Middle school	68	97.9	419.8
	High school	57	476.0	1713.2

Data are presented as number of bacteria.

M, mean; SD, standard deviation.

^* P-value by one way ANOVA test.

^a,bSame letter means no statistical difference by Scheffe test.

미생물 양을 로그지수로 변환 시켰을 때 Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Lactobacillus casei에서 연령에 따른 세균의 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(P<0.05, Table 4).

Table 4

The amount of oral microbes in all subject

Microorganism	Age group	N	The amounts of oral microbes

			M	SD	P-value*
S. mitis	All	146	4.19	0.83	0.003
	Primary school	21	4.08^ab	0.70
	Middle school	68	4.43^b	0.67
	High school	57	3.94^a	0.98
S. mutans	All	146	2.17	1.82	0.031
	Primary school	21	1.22^a	1.48
	Middle school	68	2.40^b	1.65
	High school	57	2.26^b	2.04
S. sobrinus	All	146	0.04	0.31	0.178
	Primary school	21	0.15	0.67
	Middle school	68	0.03	0.26
	High school	57	0.00	0.00
L. casei	All	146	0.57	1.06	0.008
	Primary school	21	0.07^a	0.32
	Middle school	68	0.48^ab	0.95
	High school	57	0.86^b	1.25

Data are presented as log10 number of bacteria.

M, mean; SD, standard deviation.

^* P-value by one way ANOVA test.

^a,bSame letter means no statistical difference by Scheffe test.

3. 구강미생물 감염자의 평균 구강미생물 양과 상관관계

구강미생물 감염자에 대해 Streptococcus mitis는 총 146명 중 145명으로 평균 양이 42996.9로 나타났으며(P<0.05), Streptococcus mutans는 92명으로 평균 양이 16129.4로 초등학생 1254.4, 중학생 7907.8, 고등학생 31915.8로 미생물 감염자의 연령이 증가할수록 평균 미생물의 양도 증가하였다(P<0.05, Table 5).

Table 5

The amount of oral microbes in subject who have each oral microbe

Microorganism	Age group	N	The amounts of oral microbes

			M	SD	P-value*
S. mitis	All	145	42996.9	49601.3	0.008
	Primary school	21	31257.1^a	39085.5
	Middle school	68	56412.5^a	56326.9
	High school	56	31108.9^a	40024.7
S. mutans	All	92	16129.4	31866.7	0.001
		Primary school	9	1254.4^a		1625.0
		Middle school	49	7907.8^ab		12265.1
		High school	34	31915.8^b		46511.9
S. sobrinus	All	2	670.0	749.5	-
	Primary school	1	1200.0
	Middle school	1	140.0
	High school	0
L. casei	All	37	914.1	2100.4	0.460
	Primary school	1	30.0
	Middle school	15	444.0	823.8
	High school	21	1292.0	2666.7

Data are presented as number of bacteria.

M, mean; SD, standard deviation.

^* P-value by one way ANOVA test.

^a,bSame letter means no statistical difference by Scheffe test.

Streptococcus mitis와 Streptococcus mutans에서 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(P<0.05, Table 6).

Table 6

The amount of oral microbes in subject who have each oral microbe

Microorganism	Age group	N	The amounts of oral microbes

			M	SD	P-value*
S. mitis	All	145	4.21	0.76	0.006
	Primary school	21	4.08^a	0.70
	Middle school	68	4.43^a	0.67
	High school	56	4.01^a	0.83
S. mutans	All	92	3.45	0.92	0.010
	Primary school	9	2.85^a	0.47
	Middle school	49	3.33^ab	0.81
	High school	34	3.78^b	1.05
S. sobrinus	All	2	2.62	0.66	-
	Primary school	1	3.08
	Middle school	1	2.15
	High school	0	2.15
L. casei	All	37	2.25	0.79	0.516
	Primary school	1	1.48^a	0.79
	Middle school	15	2.17^ab	0.65
	High school	21	2.34^b	0.88

Data are presented as log10 number of bacteria.

M, mean; SD, standard deviation.

^* P-value by one way ANOVA test.

^a,bSame letter means no statistical difference by Scheffe test.

구강미생물 간의 상관관계 분석결과, Streptococcus mutans와 Lactobacillus casei 간에 높은 상관성이 있는 것으로 나타났다(R=0.683, P<0.001, Table 7).

Table 7

Correlation between oral microorganisms

	S. mitis	S. mutans	S. sobrinus	L. casei
S. mitis	-	―0.108 (0.246)	0.068 (0.467)	―0.123 (0.188)
S. mutans	―0.108 (0.246)	-	―0.042 (0.654)	0.683 (<0.001)
S. sobrinus	0.068 (0.467)	―0.042 (0.654)	-	―0.024 (0.797)
L. casei	―0.123 (0.188)	0.683 (<0.001)	―0.024 (0.797)	-

Data are presented as Pearson Correlation and Significant (2-tailed).

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고 안

치아우식증은 범발적이고 누진적인 만성질환이지만 체계적인 관리를 하면 예방이 가능한 질환이다¹³⁾. 따라서 청소년기는 일생의 구강건강을 결정하는 중요한 시기이므로 건강한 삶을 위하여 치아우식증의 예방을 위해 철저한 관리가 필요한 시기이다.

이러한 치아우식증의 원인균으로 알려진 연쇄상 구균을 총칭하여 Streptococcus mutans라고 하며¹⁴⁾, 주로 Streptococcus mutans 및 Streptococcus sobrinus, Streptococcus mitis 등이 있으며¹⁵⁾, 이를 포함하여 Lactobacillus casei, Actinomyces 등이 관여하는 것으로 알려져 있다¹⁶⁾.

Chosack 등¹⁷⁾은 타액 내 Streptococcus mutans 수가 치아우식 발생에 영향을 끼친다고 보고함으로써 높은 수를 가진 사람은 우식 위험도가 매우 높다고 하였으며, Klock 등¹⁸⁾ 은 Streptococcus mutans가 증식과 함께 우식발생이 증가됨에 따라 Streptococcus mutans의 수도 일반적으로 증가한다고 보고한 바 있다. 이번 연구에서도 연구대상자 146명 중 145명이 Streptococcus mutans의 감염자로 나타났으며, 구강미생물 감염률은 Streptococcus mitis 100% (146명), Streptococcus mutans 76.7% (89명), Streptococcus sobrinus 1.7% (2명), Lactobacillus casei는 30.2% (35명)로 나타났다.

Klock 등¹⁸⁾은 스웨덴의 청소년과 성인을 대상으로 연구한 결과, 나이에 따른 우식과 타액 원인균 분포 또는 분비율과의 관계는 차이가 없다고 하였으나, 이번 연구에서는 Streptococcus mutans는 초등학생 평균 537.6, 중학생 5698.2, 고등학생 19037.5로 연령이 증가할수록 구강미생물의 평균 양이 증가하는 것으로 조사되었다(P<0.05). 또한, Lactobacillus casei는 유의성이 없는 것으로 나타났지만, 초등학생 1.4, 중학생 97.9, 고등학생 476.0으로 연령이 증가할수록 미생물 평균의 양이 증가하였다.

구강미생물간의 상관관계를 분석결과 역시 Streptococcus mutans와 Lactobacillus casei 간에 높은 상관성이 있는 것으로 나타났다(P<0.001). Gábris 등¹⁹⁾ 또한 우식 원인균인 Streptococcus mutans와 Lactobacilli의 수 사이에 상관관계가 있다고 보고하였으며, 이는 본 연구결과와 일치하였다. 이와 같은 결과는 우식 와동이 형성될 때까지 초기에는 Streptococcus mutans가 작용하고, 그 이후 Lactobacillus casei는 우식이 계속 진행되도록 하는 결과로 사료된다.

또한 연령이 증가함에 따라 치아우식 원인균의 증가는 청소년기의 치아우식증에 영향을 끼칠 수 있을 것이라 사료된다. 또한 치아는 한번 우식에 이환되면 다시 원래 상태로 되돌릴 수 없는 비가역적 손상을 입으며, 이환된 정도나 양에 따라 계속 축적되는 질환으로 청소년기는 치아우식증 증가의 중요성 인식 강화를 위한 교육을 통해 구강건강 습관 형성과 구강관리 태도 변화로 이행될 수 있도록 하는 것이 매우 중요하다고 사료된다.

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결 론

아동 및 청소년 연령층에서 치아우식과 관련된 세균의 감염률을 확인하고자 146명을 대상으로 구강검사와 realtime PCR을 이용한 세균양 검사를 시행하였다. 그 결과 구강미생물 감염률은 총 146명 중 Streptococcus mitis는 99.3% (145명), Streptococcus mutans 63.0% (92명), Streptococcus sobrinus 1.4% (2명), Lactobacillus casei는 25.3% (37명)로 나타났다. 연령에 대한 Streptococcus sobrinus와 Lactobacillus casei는 차이가 없는 것으로 나타났으나(P>0.05), Streptococcus mutans는 초등학생 평균 537.6, 중학생 5698.2, 고등학생 19037.5로 연령이 증가할수록 구강미생물의 평균 양이 증가하는 것으로 조사되었다(P<0.05). 구강미생물 감염자에 대해 평균 미생물 양은 Streptococcus mitis와 Streptococcus mutans에서 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(P<0.05). 미생물 양을 로그지수로 변환하였을 때 또한 Streptococcus mitis와 Streptococcus mutans에서 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(P<0.05). 구강미생물간 상관관계 분석 결과 Streptococcus mutans와 Lactobacillus casei 간에 높은 상관성이 있는 것으로 나타났다(R=0.683, P<0.001). Streptococcus mutans가 증가할수록 Lactobacillus casei가 증가하는 것으로 나타났다.

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Realtime PCR법에 의한 청소년의 치아우식 유발세균 감염률 조사