정상 오가노이드를 생성하는 세포의 기원은 성체 조직에서 유래하는 조직 특이적 성체 줄기세포(adult stem cells)와 만능 줄기세포(pluripotent stem cells)이다[11-13]. 성체 줄기세포는 모든 조직 유형에 존재하면서 조직 유지 및 손상 회복을 담당하는 줄기세포이므로 성체 줄기세포 유래 오가노이드는 조직 항상성과 재생을 연구하는 데 적합하다[14]. 만능 줄기세포에는 배아 줄기세포(embryonic stem cells)와 만능유도 줄기세포 (induced pluripotent stem cells) 등 두 종류 모두 오가노이드를 만들 수 있으나, 인간 배아 줄기세포는 확보성과 윤리성 문제로 오가노이드 제작에 거의 사용되지 않고 주로 만능유도 줄기세포가 오가노이드 제작에 많이 사용된다.

성체 줄기세포 오가노이드는 정상조직의 줄기세포가 항상성을 유지하기 위해 사용하는 인자들을 모방하여 배양액에 칵테일 형태로 첨가하는 방식으로 유도된다. 오가노이드 배양배지에는 성체 줄기세포 자가재생을 위한 생체 내 미세환경을 모방하는 다양한 성장인자, 분화 자극제 그리고 생리활성 저분자 화합물들이 포함되며, 또한 줄기세포의 체외 증식 및 3D 조직화를 위해 필요한 지지대로서의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 등이 필요하다[15]. 성체 줄기세포 오가노이드의 기본배지에는 Advacned Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12, 페니실린/스트렙토마이신, 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산, GlutaMAX, N2, B27, 니코틴아마이드, N-아세틸시스테인 등으로 구성되어 있다. 이 기본배지에 줄기세포 서식지 조절인자, 세포 성장인자, 세포 분화인자, 세포생리 활성인자들이 각 조직의 기원에 따라 적절하게 구성된다(Table 1). 필수적인 조직 줄기세포 서식지 조절인자에는 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF), Wnt3A, R-스폰딘(R-spondin) 그리고 노긴(Noggin) 등을 포함한다. EGF는 Ras 신호전달 경로를 활성화하여 세포증식을 촉진하고, Wnt 신호로 작용하는 Wnt3A와 R-스폰딘은 소화관에서 활성 줄기세포 유지에 중요한 역할을 한다[16-18]. 또한 골형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)은 Wnt/β-catenin 신호를 억제함으로써 장 줄기세포의 자가재생을 억제하지만, 이 BMP 신호가 Noggin에 의해 억제되어 줄기세포가 장기간 배양 조건에서도 안정적으로 유지된다[19,20]. 소화관 발달 과정에서 세포 증식을 촉진하고 분화를 억제하는 것으로 알려진 피부아세포 성장인자(fibroblast growth factor 10, FGF10) 또는 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor)는 위, 간, 췌장 오가노이드 배양에 필요하다[9,21].

세포신호전달 억제제인 A83-01은 액티빈 수용체 유사 키나제(activin receptor-like kinase)의 강력한 억제제로서 결장 상피세포의 증식을 억제하고 세포자멸사 및 분화를 촉진하는 TGF-β 신호전달을 억제하는 것으로 보고되었다[22]. Y-27632는 세포 투과성이 뛰어나고 Rho-연관 단백질 인산화효소(Rho-associated protein kinase)의 매우 강력하고 선택적인 억제제로서 간 오가노이드의 효과적인 생성에 필요하며, SB202190은 p38 MAP 키나아제의 선택적이고 강력한 세포투과성 억제제로서 도말 효율을 향상시키고 인간 결장 오가노이드의 연속적인 통과를 촉진한다[23,24].

그 외 세포 생리 활성인자인 가스트린은 위 세포 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2)는 분리 유도성 세포 사멸을 억제하고 Wnt 신호를 활성화하여 오가노이드 형성을 유도하며, 니코틴아마이드는 시르투인 억제를 통해 인간 결장 오가노이드 형성을 촉진한다[25-27]. Table 1은 줄기세포의 기원에 따라 오가노이드 배양 배지에 첨가되는 다양한 칵테일 인자들의 구성인자들을 나타내고 있다[7-10,27].

ECM은 오가노이드 배양을 공간적으로 배열되고 3D 패턴화된 장기 유사 구조의 형성을 돕기 위해 필요하며, 당단백질, 프로테오글리칸, 다당류를 포함하여 다양한 물리적 및 생화학적 특성을 가진 생화학적으로 구별되는 다량의 성분으로 구성된다[28,29]. 특히 마우스 육종에서 추출한 매트리젤(matrigel)은 현재 오가노이드 배양 시스템에서 가장 널리 사용되는 ECM으로 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 헤파란 황산 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 같은 다양한 ECM 단백질로 구성되어 있어 시험관 내 세포에 생리적 환경을 제공한다[30]. 성체 줄기세포 오가노이드는 형태학적 특성과 유전체 안정성을 유지하면서 지속적인 계대 배양 및 동결보존이 가능하다[15].

만능 줄기세포 오가노이드 유도 방법은 성체 줄기세포 오가노이드 유도 방법과 근본적으로 다르다. 만능 줄기세포 오가노이드를 유도하는 방법은 배아 발생 과정 중 세포 신호전달을 모방하는 순차적인 성장인자 첨가를 통한 단계적 분화를 포함하는데, 일반적으로 배아층 유도, 조직 특이적 구형체 형성 그리고 오가노이드 구체화의 세 단계로 구성된다. 따라서 내배엽으로부터 유래되는 소화기의 오가노이드 생성에는 우선 내배엽 발생이 필수적이다[31,32]. 액티빈 A (activin A)와 골 형태형성 단백질4 (BMP4)로 내배엽을 유도한 후에[28], 전장(foregut), 중장(midgut) 그리고 후장(hindgut) 분화를 유도하기 위하여 Wnt3A, FGF4 그리고 Noggin 등 여러 성장인자를 첨가하여 매트리젤에서 배양한다[33,34].

성체 줄기세포 오가노이드와 만능 줄기세포 오가노이드는 각각의 특징에 맞추어서 암 모델로 활용되며 Table 2에서 성체 줄기세포 오가노이도와 만능 줄기세포 오가노이드로 만들어지는 암 모델의 특징을 비교하였다[35].

줄기세포 유래 암 오가노이드의 중요한 특징 중 하나는 2D 배양 새포주와 달리 생존을 위해서 서식지 인자, 세포와 세포 사이의 상호작용 그리고 세포와 기질 사이의 상호작용에 대한 의존도가 매우 크다는 것이다. 따라서 줄기세포 오가노이드를 배양하는 과정에서 필수적인 서식지 조절인자, 신호전달경로 억제제 또는 기질의 유무를 조절함으로써 발암과정에서 생기는 다양한 유전자형-표현형의 상관관계를 분석할 수 있다[36,37]. APC 또는 CTNNB1과 같은 WNT 하위 유전자에 돌연변이가 없는 성체 줄기세포 유래 암 오가노이드에 대한 연구에서 밝혀진 Wnt/R-스폰딘 독립성에 대한 메커니즘 연구결과는 종양 내 세포 상태의 형태학적 다양성과 이질성을 형성하는 데 Wnt 신호전달의 중요성을 보여주었고, 정상 위 오가노이드에서 CDH1/TP53의 이중 녹아웃은 R-스폰딘 독립성과 관련된 확산성 위암 표현형을 야기하였다[36,38]. 이와 같이 줄기세포 오가노이드의 서식지 인자, 세포-세포, 세포-기질사이의 의존성 때문에 줄기세포 오가노이드 연구를 통해서 세포-세포/세포-기질 독립성이 침윤성 종양 경계, 진행성 종양 병기 및 전이, 그리고 위암 환자의 생존 기간과 관련된 전사체 특징들과 상관관계가 있음을 보여주었다[37].

또 다른 특징은 줄기세포 유래 암 오가노이드는 기원 조직의 가계 다양성(lineage diversity)과 세포 가소성(cellular plasticity)을 보존한다는 것이다. 윌름스 종양 유래 오가노이드에 대한 단일 세포 RNAseq 분석결과는 이 오가노이드가 세 가지 다른 세포 유형(상피, 기질, 모세포)으로 구성되어 있음을 보여준다[39]. 또 다른 연구에서 외인성 Wnt3a와 R-스폰딘의 제거 또는 보충은 확산형 위암 또는 CDH1/TP53 이중 녹아웃을 가진 정상 위 오가노이드의 조직학적 아형 특성화 및 세포의 가소성을 조절할 수 있다는 것을 보여주며, 이 연구결과는 인간 위암의 생체 내 상황과 매우 유사하다[40]. 또한 췌장관선암은 전사체 분석을 통해서 두 가지 세포 상태, 즉 공격적인 기저 유사 상태와 고전적 상태로 분류할 수 있는데 TGF-β로 처리된 오가노이드는 더욱 공격적인 기저 유사 상태로 유도된 반면, TGF-β를 제거하면 오가노이드는 고전적 상태로 되돌아가는 것이 밝혀졌다[41]. 이러한 결과는 성장 조건이나 미세환경이 세포 가소성과 세포 상태를 조절할 수 있음을 시사하며, 이러한 줄기세포 유래 오가노이드의 특징은 2D 배양 세포주 연구에서는 제한적이었던 인간 암에서 종양 가소성과 세포 상태 전이 메커니즘에 대한 연구를 할 수 있다는 가능성을 보여준다.

줄기세포 유래 암 오가노이드는 원발성 종양의 종양 내 이질성(intraltumoral heterogeneity)과 아클론(subclone) 구조를 유지하는 능력을 가지고 있다. Gastric cancer (GC) 오가노이드 코호트 연구에서 ERBB2 또는 FGFR2의 발암성 증폭이 있는 집단과 증폭이 없는 집단이 관찰되었는데 이는 생체 내 종양 조직에서 관찰되는 국소적 이질성을 모방하였으며, 장기간 배양에서도 유지되는 것을 확인하였다[42]. 그리고 엡스타인-바 바이러스(epstein-barr virus, EBV) 관련 위암 또는 비인두암(nasopharyngeal carcinoma, NPC)에서 배양된 오가노이드에서는 EBV 바이러스 유전체와 바이러스 잠복기를 유지하는 것으로 나타났는데, 이는 이미 EBV 유전체를 소실한 대부분의 2D NPC 세포주와는 대조적으로 줄기세포 유래 암 오가노이드가 감염 관련 암에 대한 연구를 가능하게 한다[42,43]. 따라서 암 오가노이드는 2D 세포주에 비해 원발 종양을 더욱 정확하게 재현하여 신호 전달 경로, 종양 내 이질성, 그리고 감염 관련 종양 형성을 연구하는 강력한 도구를 제공한다.

암 발생의 시작과 진행은 일반적으로 종양 유발 유전자의 돌연변이가 점진적으로 축적되어 발생하므로 암 발생을 유발하는 돌연변이 과정을 이해하는 것은 매우 중요하다[44]. 상피장기에 있는 암들은 고령인구와 관련된 흔한 악성 종양이지만 성체 줄기세포에서 체세포 돌연변이가 축적되는 요인과 이들이 악성 전환에 어떻게 기여하는 지에 대해서는 아직도 잘 알려지지 않았다. 소화기 암 발생과 관련된 수많은 돌연변이를 확인하기 위하여 전장 유전체 시퀀싱(whole-genome sequencing) 기법이 사용되고 있지만 이러한 돌연변이들의 대부분은 종양 유발 기능을 가지고 있는지 아직 밝혀지지 않았다. 장 선와(intestinal crypt)는 체세포돌연변이 및 클론 확장을 연구하는 독특한 모델을 제공하는데 장 점막에서 배양된 풀 오가노이드 배양은 일반적으로 다클론성이며 여러 샘의 집합체에서 유래하며, 각 개별 선와는 대부분 패신저 돌연변이(passenger mutation)로 구성된 아클론성 체세포 돌연변이(subclonal somatic mutation)를 특징으로 하지만 결국 서로 경쟁하며 단일클론성으로 이동한다. 따라서 개별 정상세포에서 유래한 클론 오가노이드는 암 발생과 진행과정을 이해하는 매우 귀중한 암 진행 연구모델이 될 수 있다[42].

줄기세포 유래 오가노이드는 장기간 배양 후에도 유전적 및 표현형적 안정성을 유지할 수 있는데, 여기에 특정 유전체 유전자 좌에 DNA 이중 가닥 절단을 유도하는 새로운 유전체 편집도구인 CRISPR-Cas9을 접목하면 훨씬 강력한 암 발생 및 진행 모델이 될 것이다. 대장암에서 빈번하게 돌연변이가 발생하는 네 가지 유전자 APC, TP53, KRAS 그리고 SMAD4를 CRISPR-Cas9 기법을 활용하여 건강한 대장 오가노이드에 순차적으로 도입하여 변이 오가노이드를 관찰한 연구에서 APC와 TP53 손실이 대장암에서 염색체 불안정성과 이수성의 주요원인임을 발견했다[45,46].

줄기세포 유래 오가노이드의 돌연변이 특징을 재현하는 것은 미생물 감염을 통해서 이루어질 수 있다. 다른 악성종양과 달리 소화기 암은 병원성 감염과 상당한 관련성을 보이는 데 위암의 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 간 세포암의 간염바이러스 그리고 담낭암의 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 등이 주요 암 유발 감염체이다. 그러나 감염원과 암 진행 사이의 명확한 관련 기전은 잘 알려져 있지 않다. 따라서 줄기세포 유래 오가노이드는 병원체 감염 연구를 위한 유용한 모델이 될 수 있다. 배양 세포에서 이중가닥 DNA 절단을 유도하는 유전독성을 가진 pks+ 대장균을 5개월 동안 반복하여 대장 오가노이드에 주입한 결과 다른 암 유형에서는 관찰되지 않지만 일부 대장암 환자에서 발견되는 돌연변이 양상을 관찰하였다[47]. 이 연구결과는 pks+ 대장균에 대한 과거 노출경험이 해당 환자에게 잠재적 발암요인이 될 수 있음을 시사한다. 줄기세포 유래 위 오가노이드에 헬리코박터 파일로리를 미세주입법으로 감염시켰을 때, 오가노이드에서 위암 관련 유전자들의 발현증가를 관찰하였으며, 쥐 담낭 오가노이드와 살모넬라 엔테리카를 공동 배양한 연구에서는 감염된 살모넬라 엔테리카가 PKB (protein kinase B)와 MAPK 신호 전달을 활성화하여 성장인자 비의존적 성장과 악성전환을 유도한다는 것을 발견하였다[10,48]. 또한 바이러스 감염 오가노이드 모델로서 장 오가노이드에 로타바이러스 감염을 모델링하여 항바이러스 약물의 효과를 보고하였는데, 이것은 줄기세포 유래 인간 간 오가노이드 모델을 이용하여 시험관 내에서 B형 간염바이러스(hepatitis B virus) 감염 및 증식을 연구할 수 있는 잠재력을 보여준다[49,50]

소화기 암 환자 유래 암 오가노이드는 원래 종양의 유전적, 전사체적 조직학적 특성을 유지하고 있어서 새로운 항암제를 발굴하고 시험하는 데 진보된 모델로서 대규모 로봇 약물 스크리닝에 적용될 수 있다[51]. 환자유래 대장암 오가노이드를 사용한 연구에서 TP53 돌연변이를 가진 오가노이드는 nutlin-3a에 내성을 보였고, KRAS 돌연변이를 가진 오가노이드는 EGF 수용체 억제에 반응하지 않는 것을 발견했다[51]. 다양한 소화기 암 오가노이드에서 약물 스크리닝 분석뿐만 아니라, 세포 생존율 분석에서 이미지 기반 고함량 표현형 분석, 오가노이드 모델로 표준 치료법에 대한 임상 반응을 에측하는 능력 그리고 환자의 치료 반응을 예측하는 데 있어 오가노이드 모델의 견고성이 입증되고 있다[52,53]. 또한 여러 진행성 직장암 오가노이드 모델은 약물 반응 예측 외에도, 시험관 내 화학방사선 요법에 대한 반응 예측뿐 아니라, 내강 내 주사를 통해 마우스 직장에 이식한 생체 내 화학방사선 요법에 대한 반응 예측 가능성을 보여주었다[3,54].

최근에는 면역체계를 오가노이드 배양에 통합하려는 시도로서 한 연구팀이 대장암과 비소세포폐암 환자의 암세포로부터 유래한 암 오가노이드를 제작한 후 환자의 혈액에서 분리한 면역세포와 함께 배양한 연구에서 암 오가노이드를 공격하는 면역세포의 수가 증가하는 것을 발견하였고, 동일한 환자의 암이 없는 정상조직을 사용한 건강한 오가노이드를 만들어 동일한 실험을 수행한 결과에서 배양된 면역세포는 건강한 오가노이드를 공격하지 않는 것을 발견하였다[55]. 이 연구결과는 환자 유래 암 오가노이드를 개인 맞춤형 항암 면역치료제로 활용될 수 있다는 가능성을 제시하였다.

CRISPR-Cas9 기술은 기존 유전체 편집도구보다 훨씬 편리하고 효율적인 새로운 유전체 편집도구로서 암을 재현하기 위해 조합 유전자 돌연변이를 가진 건강한 오가노이드를 제작하는 데 사용된다. CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 APC, TP53, KRAS, 또는 PIK3CA와 SMAD4 돌연변이를 조합하여 사중 돌연변이를 유발한 인간 장 오가노이드는 모든 줄기세포 서식지 조절인자로부터 독립적으로 성장하고 생쥐에서 침습성 암종 특징을 가진 종양 이식편을 형성할 수 있다는 것이 입증되었고, 이러한 사중 돌연변이 오가노이드를 생쥐 맹장에 동소 이식한 결과, 거시적인 폐 및 간 전이가 발생하는 것을 관찰하였다[46,47,56].

이러한 오가노이드는 모든 서식지 조절인자로부터 독립적으로 성장할 수 있으므로, 이 결과는 서식지 비의존성이 전이를 매개할 가능성을 제기한다[56].

이와 같이 CRISPR-Cas9 기술을 이용하여 인간 위 오가노이드에 ARID1A 및 TP53 돌연변이를 조작한 위암 모델링, 췌장 오가노이드에 KRAS, CDKN2A, TP53 및 SMAD4 돌연변이를 조작한 췌장암 모델링, 인간 담관 오가노이드에 TP53, SMAD4, NF1, PTEN 및 BAP1 돌연변이를 조작한 담관암 모델링, 쥐 식도 오가노이드에 Sox2 과발현 및 p53 및 p16 돌연변이를 조작한 식도 편평상피암 모델링 등 다양한 조직의 정상 오가노이드에서 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 사용하여 다른 유형의 암을 성공적으로 모델링한 사례가 발표되어지고 있다[31,45,57-59]. 이러한 새로운 유전자 편집 기술을 이용하여 유전성 암이나 희귀 유전 질환 모델링이 가능해지고 있으며 이것을 이용한 신약 후보 물질 개발이 가속화되고 있다.

최근에는 3D 바이오 프린팅 기술을 활용하여 오가노이드의 구조적 복잡성을 높이고, 대량 생산 가능성을 보여주는 연구가 진행되고 있다. 3D 바이오 프린팅 기반 모델을 사용하여 암 관련 섬유아세포, 내피세포, 평활근 세포 등 조직 기질의 주요 구성요소를 사용하여 방광암 오가노이드를 3D로 재구성한 다층 어셈블로이드(multilayer-assembloid)를 제작하였다[60]. 이 어셈블로이드 분석결과 섬유아세포에서 분비된 BMP가 종양에서 FOX1 발현을 유도하는 파라크린 루프(paracrine loop)가 발견되었고 어셈블로이드는 기존 방광 종양 오가노이드에 비해 항암제에 대한 민감도가 낮은 것을 확인하였다. 또한 3D 바이오프린팅 기법은 오가노이드의 기능성과 생존 가능성을 크게 향상시켰다.

오가노이드 배양 환경을 더욱 정교하게 조절하기 위한 노력으로서 마이크로플루이딕스(microfluidics) 기술 개발이 활발히 진행되고 있다. 마이크로플루이딕스 기술은 오가노이드에 영양분과 산로를 지속적으로 공급하고 노폐물을 제거하여 장시간 동안 안정적으로 유지할 수 있도록 한다. 췌장암환자 유래 암 오가노이드를 마이크로플루이딕스 기술을 이용하여 제한된 양의 샘플양으로 글리코겐 합성효소 기나제 억제제를 포함하는 여러 항암 화학요법에 대한 췌장암 오가노이드의 반응을 시험하였다[61]. 이 연구결과는 마이크로플루이딕스 기술은 암 생검을 기반으로한 개인 맞춤형 항암화학요법 또는 면역요법 치료에 효과적으로 사용될 가능성을 보여주었다.

암의 발생과 진행과정 연구와 개인 맞춤형 암 치료 및 신약개발에 줄기세포 유래 오가노이드가 기존의 2D 암세포주 배양이나 이종이식보다는 휠씬 실질적인 연구를 수행할 수 있지만 아직도 극복해야 할 몇 가지 문제점들이 있다(Table 3). 첫 번째는 줄기세포 유래 암 오가노이드가 3D 입체 구조를 가지고 있기는 하지만 여전히 혈관, 면역세포, 신경세포, 기질 조성 등을 포함한 복잡한 종양 미세환경을 완벽하게 재현할 수는 없다는 것이다. 종양 진행 및 약물 저항성은 종양세포 자체뿐만 아니라 종양 미세환경에 상당한 영향을 받고 있다. 최근에는 이러한 단점을 보완하기 위하여 공동배양 시스템을 도입하여 더 정교한 암 오가노이드 모델을 구현하기 위해 노력하고 있다. 만능 줄기세포 유래 신경능선 세포를 장 오가노이드와 공동배양하여 정상적인 장 신경계를 재현하는 연구에서 만능 줄기세포 유래 신경세포는 장 오가노이드와 재조합하여 장의 신경계와 유사한 신경교세포를 형성하고 신경활동을 보이는 것을 확인하였다[62]. 특히 3D 바이오 프린팅 기법을 이용하여 암 관련 섬유아세포, 내피세포, 평활근 세포 등 여러 주요 구성요소들로 다층 어셈블로이드 형태의 방광암 오가노이드를 제작하였다[60].

또 다른 극복해야 할 과제는 환자 유래 암 오가노이드를 제작하는 데 있어서 정상세포의 오염이다. 일반적 오가노이드 배양 조건에서는 정상조직 유래 오가노이드가 암 조직 유래 오가노이드 보다 성장 속도가 더 우세하여 배양조건이 특별히 암세포에 유리하지 않은 조건에서는 정상 조직 유래 오가노이드가 과도하게 증식하게 된다[38,48,63]. 특히 암 오가노이드와 정상 오가노이드는 형태적으로 구별하기 어렵기 때문에 전체 엑솜 시퀀싱 등을 이용하여 암 오가노이드의 순도를 검증하고 있다. 따라서 샘플 채취할 때부터 정상세포의 오염을 주의해야 하며, 정상세포에 불리하고 암세포에 유리한 배지조건 등을 개발함으로써 이 문제를 극복할 수 있다.