Low-density lipoprotein (LDL) 콜레스테롤은 다양한 역학 및 임상 연구를 통해 심혈관 질환 발생의 독립적인 위험 요소로 확인되었다[1-3]. 또한 2023년 발표된 미국 심장학회(American College of Cardiology, ACC) 및 미국 심장 협회(American Heart Association, AHA)의 최신 가이드라인에서도 LDL 콜레스테롤(LDL-C) 농도를 고지질혈증의 주요 진단 및 치료 기준으로 제시하고 있다[4].

LDL-C의 참고측정법(reference method)은 초원심분리(ultracentrifugation)와 침전(precipitation)을 통해 아포지단백 B (apolipoprotein B)를 포함하는 분획을 분리한 뒤, 해당 분획에서 콜레스테롤을 측정하는 β-정량법(β-quantification)이다. 비록 β-정량법이 참고측정법이지만 이 방법은 초원심분리를 통해서 밀도 1.006 이하의 VLDL을 제거하고 HDL을 침전시키고, 아포지단백 B를 포함하는 분획이므로 밀도 1.019−1.063의 LDL (narrow-cut LDL) 뿐만 아니라 밀도 1.006−1.019의 Intermediate-density lipoprotein (IDL)를 포함할 수 있는 한계점이 있으므로 β-정량법으로 산출한 LDL을 broad-cut LDL이라 명명하기도 한다. 이 방법은 검사과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며, 숙련된 검사자가 필요하기 때문에 임상검사실에서 일상검사로 사용되지 않는다. 전통적으로 LDL-C 농도의 측정에는 총 콜레스테롤(total cholesterol), 중성지방(triglyceride), 고밀도 지단백(high-density lipoprotein, HDL) 콜레스테롤 농도로부터 간접적으로 계산하는 Friedewald법이 사용되어 왔다[5].

최근에는 LDL콜레스테롤을 직접 측정하는 균질(homogeneous)법이 널리 이용되고 있다. 현재 상업적으로 이용 가능한 모든 균질법은 정상 검체에서 참고측정법과 일치(agreement)하는 결과를 보여 CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network) 프로그램 증명을 획득하였다. LDL콜레스테롤 균질법은 측정이 간편하지만 VLDL, IDL, Lipoprotein(a), HDL 등 타 지단백의 방해를 받을 가능성이 있다. 예를 들어 2010년 Miller 등[6]은 8가지 검사법을 참고측정법과 비교하였을 때 정상인 검체에서 5가지 검사법이 NECP 총오차목표(<12%)를 충족하였으나, 이상지질혈증 또는 심혈관 질환 환자 검체에서는 모든 검사법이 NECP총오차 목표를 벗어났다고 보고하였다. 또한 참고측정법과 비교하였을 때 검사방법에 따라 평균오차가 -11.8%에서 4.1%였다고 보고하였다.

LDL은 다양한 지단백 입자로 구성된 비균질한 집단[7]으로, 지단백 입자의 물리화학적 특성에 따라 하위 분획으로 나뉠 수 있다. 이러한 기존 연구 결과는 균질법에 따라 LDL 하위분획에 대한 반응이 다르기 때문일 가능성이 있다[8-10].

이에 저자들은 Lipoprint LDL system (Quantimetrix, CA, USA, 이하 Lipoprint로 약함)을 사용하여 분리된 지단백 분획에서 본 검사실에서 사용중인 Wako법과 Roche법의 두 가지 균질법의 회수율을 조사하여, LDL 입자 크기의 이질성이 두 가지 균질법 측정에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.

본 연구에서 두 가지 균질법 간 LDL-C 농도 측정값은 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 특히 LDL-C 콜레스테롤이 낮을수록 Wako법이 Roche법보다 높게 측정되었다. 이러한 결과는 Wako법과 Roche법을 참고측정법인 β–정량법과 비교한 기존의 연구결과들과 부합하였다. Esteban-Salán 등[8]은 313명의 이상지질혈증 환자 유래의 혼합혈청의 두가지 LDL-C 농도에 대해 Wako법은 156.5± 17.4, 219.7±20.6 mg/dL로, Roche법은 142.8±16.2, 205.7±25.6 mg/dL로 측정하여 Wako법이 더 높게 측정됨을 보고하였다. 또한 β–정량법과 비교했을 때의 회귀식을 Wako법은 y=0.915×+104.8, Roche법은 y=1.052×−168.8로 보고하여 상대적으로 낮은 농도에서는 Wako법이 높게 측정됨을 보였다. 이와 유사하게, Miller 등[6, 9]은 고지혈증 환자 60명과 정상인 40명의 pooled serum의 두가지 LDL-C 농도에 대해 Wako법은 110.1, 198.9 mg/dL로, Roche법은 90.9, 174.6 mg/dL으로 측정하여 Wako법이 더 높게 측정됨을 보고하였다. 또한 β–정량법과 비교했을 때 회귀식을 Wako법은 y=0.955×+30.3, Roche법은 y=1.067×−7로 보고하였다. 이러한 결과는 Roche법에서 사용하는 selective solubilization법이 β–정량법과 비교하여 음성계통오차가 있으며[11, 12], 이 현상이 낮은 LDL-C 농도에서 더 두드러지기 때문으로 설명할 수 있다[12].

본 연구에서는 지단백 분획별 농도를 구할 수 있는 Lipoprint를 이용해 7개의 LDL 지단백 분획별로 Wako법과 Roche법의 회수율을 평가할 수 있었다. 지단백 분획에 따라 균질법 간 평균 회수율을 조사한 연구는 있지만[13-15] 본 연구과 같이 IDL 분획을 세분화하여 조사한 연구는 없었다. Sakaue 등[14]은 31명의 정상인 검체를 초원심분리로 IDL과 “narrow-cut” LDL로 분리 후 세가지 균질법(Daiichi법, Denka법, Kyowa법)으로 측정한 연구에서 IDL 분획과 “narrow-cut” LDL 분획 모두 균질법 간 회수율의 차이(IDL: Kyowa 64%, Daiichi 47%, Denka 31%; LDL: Kyowa 95%, Daiichi 87%, Denka 86%)를 보였다고 보고하였다. Fei 등[13]은 정상인의 혼합혈청에 초원심분리하여 얻은 IDL 분획을 여러 농도로 첨가하여 두 가지 균질법(Kyowa법, Daiichi법)으로 측정한 연구에서 균질법 간 회수율이 차이(Kyowa: 52.4%, Daiichi: 31.2%)를 보임을 보고하였다. Usui 등[15]은 17명의 정상인과 21명의 고지혈증 환자의 검체를 초원심분리하여 IDL을 포함한 “broad-cut” LDL의 5가지 하위분획으로 분리하여 두가지 균질법(Kyowa법, Daiichi법)으로 측정한 연구에서 분율이 가장 높은 1.019–1.040 g/mL 밀도의 분획에서 균질법 간 회수율의 차이를(Kyowa법: 88.4-92.0%, Daiichi법: 95.6–98.7%)를 보였다고 보고하였다. 또한 IDL 분획의 경우 두 방법 간 유의한 회수율의 차이를 보이지 않았지만 Kyowa법만 HPLC의 용출시간에 따라 회수율의 차이를 보여 Kyowa법의 회수율은 IDL의 입자크기에 의존적일 것이라 하였다. Yamashita 등[16]은 IDL이 증가하는 제3형고지단백혈증 환자 7명의 검체에서 네 가지의 균질법 (Daiichi법, Denka법, Wako법, Kyowa법)을 β–정량법과 비교한 연구에서 Kyowa법은 β–정량법과 비슷하게 측정된 반면 Denka법>Daiichi법>Wako법 순으로 β–정량법보다 낮게 측정되었다고 보고하였다.

본 연구에서는 IDL을 하위 분획으로 나누어 분석하였는데, VLDL과 인접한 IDLC 분획과 IDLB 분획에서는 Wako법의 평균 회수율이 Roche법보다 더 높았지만 LDL과 인접한 IDLA 분획에서는 차이를 보이지 않음을 관찰하였다. Roche법의 경우 alpha-cyclodex-trin을 이용하여 VLDL을 차단하는데, IDL 분획 중 VLDL과 인접한 IDLC 분획과 IDLB 분획 지단백 입자가 alpha-cyclodextrin sulfate에 의해 차단되어 효소반응이 일어나지 않기 때문에 평균회수율이 낮은 것으로 사료된다[8, 17, 18]. 한편, large LDL에서는 Roche법이 Wako법보다 높은 평균 회수율을 보였는데, 이는 IDL 분획에서 Roche법이 낮은 평균 회수율을 보이는 것을 상쇄하기 위해 보정한 결과일 것으로 사료된다.

본 연구에서 VLDL의 주성분으로 이를 대변하는중성지방의 농도도 균질법의 LDL-C 농도 측정에 영향이 있음을 관찰하였다. 중성지방 농도가 높을수록 Lipoprint에서 계산된 LDL-C 농도에 비해 Wako법의 LDL-C 농도(LDL-C_WK)는 높게 측정되었으나 Roche법에서는 영향이 없었다. 이는 기존 연구들의 결과, 즉 Wako법은 중성지방의 간섭이 있으나[19] Roche법은 간섭이 없거나 적은 것과 부합하는 결과이다. Sugiuchi 등[18]은 Roche법에서 사용하는 selective solubilization법은 중성지방 농도가 높아져도 β–정량법과와의 오차가 없었다고 보고하였다. Miller 등[6, 9]은 중성지방 농도가 증가함에 따라 균질법과 β–정량법의 LDL-C 오차가 Wako법> Daiichi법>Denka법 순으로 유의하게 차이가 났지만 Roche법은 유의한 bias를 보이지 않았다고 보고하였다. Esteban-Salán 등[8]은 중성지방 농도가 700 mg/dL까지는 Wako법과 Roche법 모두 유의한 bias (<5%)를 보이지 않았지만 그 이상의 농도에서는 유의한 bias를 보였는데, Wako 균질법의 LDL-C은 양성오차를, Roche 균질법의 LDL-C은 음성오차를 보인다고 보고하였다.

본 연구에서는 각 지단백의 분획에 대한 균질법의 회수율을 직접 측정하지 않고, Lipoprint를 이용해 간접적으로 추정했다는 점에서 한계가 있다. 따라서 본 연구에서의 두가지 균질법의 평균 회수율은 절대적인 값이 아닌 상대적인 값으로 비교되어야 할 것이다. 또한 본 연구에는 Lipoprint 검사를 시행 후 혈청 검체를 -20도에서 냉동 후 해동하여 균질법으로 측정하였기 때문에, 냉동 후 해동에 의한 오차를 배제할 수 없다. 그렇지만 기존 연구에서 -20도에서 12개월간 보관 후 해동하여 Roche법으로 검사하였을 때 측정값의 유의한 변화가 없었으며, -20도와 -40도에 두 달간 보관 후 해동하여 Wako법과 Roche법으로 검사하였 때 두 방법 모두 측정값의 유의한 변화는 없었다[11]. 그럼에도 냉동 후 해동시 지단백의 지질 조성이 달라질 수 있기 때문에[20] 냉동 후 해동한 검체와 신선한 검체에서 균질법으로 측정되는 지단백 분획을 비교하는 추가 연구가 필요할 것이다.

요약하면, 본 연구에서는 Wako법과 Roche법 두 가지 균질법에서 Lipoprint 지단백 분획에 따른 추정 평균 회수율의 차이를 관찰하였으며, 이를 통해 균질법 간 LDL-C 측정값의 불일치 결과를 설명할 수 있었다. 또한 중성지방 농도 역시 균질법의 측정값에 영향을 준다는 사실을 확인하였다. 이는 비정상 지단백이 생성되는 질환[21]이나 중성지방 농도가 매우 높은 환자들에서는 균질법으로 측정한 LDL-C 농도 해석 시 각별한 주의가 필요함을 시사한다. 아울러 본 연구 방법론은 Daiichi법, Denka법 등 다른 균질법에서의 LDL-C 농도값 불일치 원인을 찾는 데에도 유용하게 활용될 것으로 기대된다.