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초록
배경
고해상도 HLA 조직형은 국내에서 주로 직접염기서열분석과 NGS 검사로 확인하고 있다. 검사 결과의 신뢰성과 정확성을 위해서 검사 과정에서 발생가능한 위험도를 예측하고 고찰할 필요가 있다.
방법
위험도산정을 위해 리더 1명, 의사 2명, 병리사 3명, 통계 분석 전문가 2명으로 팀을 구성하고 각각의 전문가들이 CLSI 가이드라인(EP18)에서 제시하는 척도에 따라 중증도(severity), 빈도(occurrence), 발견가능성(detectability)의 정도를 산출하고 각 요소의 곱으로 오류 유형 및 위험도 분석의 위험도 우선순위(risk priority number)를 결정한다. 그레이 관계분석을 통해 그레이 관계등급을 산출하여 객관적인 위험도 우선순위를 결정하고 고찰한다.
결과
직접염기서열분석에서 위험도 우선순위값은 각 검사 단계에 대해 4-72까지의 분포를 보이고 그레이 관계분석에서 관계등급은 0.44-0.76을 보였다. NGS 검사에서는 위험도 우선순위값은 12-102까지의 분포를 보이고 그레이 관계분석에서 관계등급은 0.51-0.90까지의 분포를 보였다. 전체 위험도 우선순위값은 NGS 검사가 더 높은 위험도를 나타내고 있다(465 vs. 1,103). 오류유형 및 영향분석과 그레이 관계 분석을 통해 직접염기서열분석은 PCR 튜브에 DNA 첨가, 플레이트(plate)에 PCR 산물 첨가, 결과해석 및 결과 입력 단계에서 높은 위험도를 보였다. NGS 검사에서는 반응 혼합액(reaction mix)에 DNA 첨가 및 결과 해석 단계가 높은 위험도를 보였다.
결론
본 연구는 직접염기서열분석과 NGS 검사에 대한 위험도 평가를 위해 오류유형 및 영향 분석과 그레이 관계 분석을 적용한 첫번째 연구이다. NGS 검사는 직접염기서열분석보다 높은 위험도를 보였다. 고해상도 HLA 형별 검사는 튜브나 플레이트에 시약을 첨가하는 과정과 결과 해석 및 입력의 오류의 가능성이 높으므로 업무흐름(workflow)의 개선이나 자동화 도입으로 업무의 위험도 개선의 필요성이 있다.
Abstract
Background
High-resolution HLA typing is predominantly performed using sequence-based typing (SBT) and next-generation sequencing (NGS). Risk analysis is necessary to predict and evaluate potential risks in the testing process to ensure the reliability and accuracy of test results.
Methods
The risks were assessed by specialized experts, including a leader, doctors, technicians, and statistical analysts. Each expert calculated the severity, occurrence, and detectability of potential failures according to the Clinical Laboratory & Standards Institutes (CLSI) guidelines (EP18). For failure mode and effects analysis (FMEA), the risk priority number (RPN) was calculated as the product of these factors. Grey relational analysis (GRA) was used to derive the grey relational grade (GRG).
Results
For SBT, RPN values ranged from 4–72, with GRG from 0.44–0.76, while for NGS, RPN values ranged from 12–102, with GRG from 0.51 – 0.90. The total RPN indicated a higher risk for NGS (465 vs. 1,103). For SBT, FMEA, and GRA identified high risks in adding DNA to PCR tubes or PCR products to plates, and in interpreting and inputting the results. For NGS, high risks were found in adding DNA to the reaction mix and result interpretation.
Conclusions
This is the first study to apply FMEA and GRA to risk assessment in SBT and NGS for high-resolution HLA typing. NGS presented higher risks compared to SBT. It is necessary to improve workflows or introduce automated processes to reduce risk when adding reagents or mixtures and interpreting and inputting results.
Keywords: Risk analysis, Failure mode and effects analysis, Grey relational analysis, HLA typing, Next-generation sequencing, Sequence-based typing
서 론
Human leukocyte antigen (HLA) 형별 검사는 이식에서 기증자와 수혜자 간의 이식 적합성을 평가하고 자가 면역 질환의 유전적 요인을 이해하는데 중요한 결과를 제공하는 검사이다[
1]. HLA 형별 검사는 저해상도(혈청학 수준), 중증도해상도(대립유전자 그룹 수준), 고해상도(대립유전자 수준)로 분류할 수 있다[
2]. 고해상도 HLA 형별 검사는 염기서열 기반 검사(sequence-based typing)로서 이식 예후 예측을 위해 필요한 주요 HLA 부위인 HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 및 -DPB1에 대한 두 대립유전자를 식별하고 신뢰할 수 있는 결과를 제시한다[
2]. 최근에는 차세대염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)이 개발되어 기존의 대립유전자 모호성(ambiguity)을 개선하고 대량의 검사를 가능케 하여 시간과 비용 면에서 획기적인 혁신을 가능케 하였다[
3].
모든 진단의 80-90%가 검사 결과를 기반으로 이루어지기 때문에 검사 결과가 환자 안전에 주요한 영향을 미친다[
4]. 모든 검사 결과에 대해 0.012-0.6%의 빈도로 검사실 오류가 발생한다[
4]. 모든 검사 과정의 검사실 오류와 위험을 줄이고 질 관리(quality control) 시스템 개선을 위해 규제 및 지침서 등의 도입이 이루어졌다[
5-
7]. International Society for Quality for Health Care (ISQua) 에서는 위험 관리의 필요성과 표준화된 방법을 제시하였다[
5]. 그에 따라 임상화학, 진단혈액 및 수혈의학과 같은 다양한 진단검사의학과 분야에서 검사실의 질 향상을 위해 검사 방법과 관련된 위험평가 및 관리가 적극적으로 행해져 왔다[
8,
9].
위험 관리의 가장 선제적인 방법 중 하나인 오류유형 및 영향분석(failure mode and effects analysis, FMEA)은 검사 과정의 잠재적인 오류 지점을 확인하고, 그것의 영향을 결정하고, 오류를 줄이기 위한 대처사항을 확인하는 방법으로 사용되었다[
10-
12]. 오류유형 및 영향분석의 첫 번째 단계는 검사 과정의 모든 잠재적인 오류유형을 식별하는 것이다. 그 후, 이러한 오류유형에 대해 분석을 수행하고 중증도, 빈도, 발견가능성의 곱으로 위험도 우선순위(risk priority number, RPN)를 계산한다. 마지막으로, 오류유형을 순위별로 나열하고 고위험 오류유형에 대하여 우선적으로 조치를 취한다[
13]. 오류유형 및 영향분석의 적용은 ISO 9001:2015에서 제시하는 위험 기반 사고와 일치하며, 검사 결과의 신뢰성을 보장하는데 중요한 역할을 한다[
14]. 그러나 Shebl 등[
15]은 오류유형 및 영향분석이 위험 관리에서 점수 척도와 오류 우선 순위에 대한 표준화가 부족하다고 보고하였다. 특히 서로 다른 구성원들이 점수화한 척도에 대한 기준이 모호하고 차이가 커서 다른 결과를 산출한다고 지적하였다[
14]. 이러한 오류유형 및 영향분석의 단점을 극복하기 위해 유사성(similarity)와 다양성(variability) 수준에 따라 개별 데이터 간의 관계를 분석하는 그레이 관계분석(grey relational analysis)의 적용이 가능하다[
16]. 그레이 관계분석은 원 데이터를 기반으로 하고, 간단하며 단순하게 이해할 수 있는 계산법을 적용하여 의사결정에 활용 가능하다.
그러나 HLA 형별 검사에 대해 오류유형 및 영향분석과 그레이 관계분석을 적용한 연구는 없었다. 따라서 본 연구에서는 고해상도 HLA 형별 검사인 직접염기서열분석(direct sequencing)과 NGS 검사에 대하여 오류유형 및 영향분석과 그레이 관계분석을 적용하여 상대적 위험을 객관적 지표로 평가하는 것을 목표로 한다.
재료 및 방법
1. 연구방법
본 연구는 2022년 7월부터 2023년 5월까지 고려대학교 안암병원에서 진행되었고, 고려대학교 윤리위원회(K2023-0107)의 승인을 받았다. HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3, -DRB4, -DRB5, -DQB1, -DQA1, -DPB1, -DPA1에 대해서 대립유전자형을 확인하는 직접염기서열분석과 NGS 검사 방법에 대한 위험도를 평가하였다. 직접염기서열분석은 제조사의 지침에 따라 AVITA plusTM HLA SBT 키트(Biowithus Inc., Seoul, Korea)와 BigDye Terminator 혼합물(Biowithus Inc., Seoul, Korea)을 사용하여 수행하였다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭, PCR 산물 정제 및 염기서열분석 반응은 GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (PE-Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 염기서열분석된 결과는 BIO-WITHUS SBT Analyzer 소프트웨어 ver. 2.7.5 (Biowithus Inc.)를 사용하였다. NGS는 제조사의 지침에 따라 NGSgo®-AmpX c2 HLA 키트(GenDx, Utrecht, Netherlands)와 NGSgo® Library Full 키트(GenDx, Utrecht, Netherlands)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭, 어댑터 연결을 통한 절편화, 그리고 인덱싱 PCR은 GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (PEBiosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 라이브러리 증폭 및 염기서열분석은 Miseq 플랫폼(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)에서 수행하였다. 유전자형은 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스 버전 3.51.0을 기반으로 GenDx의 NGSengine 버전 2.30.0.28772를 사용하여 할당되었다.
2. 오류유형 및 영향분석
오류유형 및 영향분석은 진단검사의학과 전문의인 리더 1명, 진단검사의학과 전공의 2명, 병리사 3명, 직접염기서열분석과 NGS 검사 장비업체의 학술파트 분석 전문가 2명으로 팀을 구성하였다. 팀 구성원은 각 검사 단계에 대하여 잠재적인 오류 유형, 효과, 원인 및 결과에 대하여 기술하였다. 잠재적 오류유형은 Clinical & Laboratory Standard Institute (CLSI) guideline에서 제시하는 기준에 따라서 중증도(Severity, S), 빈도(Occurrence, O), 발견가능성(Detectability, D)에 대하여 평가한다[
11]. 중증도(S)는 검사과정에서 발생 가능한 오류유형의 영향을 나타내고 그 정도에 따라 “최소, 매우 경미, 경미, 부분, 중간, 상당, 심각, 매우 심각, 치명, 사망”으로 나누고 1-10점으로 평가한다. 빈도(O)는 오류유형의 발생 빈도로 정의 하고 “매우 낮음, 낮음, 중간, 높음, 매우 높음”으로 나누어 1-10점으로 평가한다. 발견가능성(D)은 잠재적 오류가 발생하기 전 확인되지 않을 가능성을 의미하고 “매우 용이, 용이, 보통, 어려움, 매우 어려움”으로 나누고 1-10점으로 평가한다[
8-
11,
19]. 세가지 요인의 곱을 통해 위험도 우선순위(risk priority number, RPN)를 산출하고 그 값이 높을수록 오류유형이 발생할 가능성이 높고, 발생 후 좀 더 심각한 결과를 미칠 수 있고, 발견가능성이 낮으며, 개선의 필요성이 시급함을 의미한다. 팀 구성원 평가에 대한 객관성 유지를 위해 팀 구성 후 CLSI guideline 및 ISO 9001:2015에 대한 검토를 함께 진행하고, 평가 직전에 잠재적 오류유형 기준에 대한 재정립 및 검토를 시행하였다.
3. 그레이 관계분석
오류유형 및 영향분석의 단점을 제거하고 위험도 우선순위 결과를 검증하기 위해 본 연구에서는 그레이 관계분석을 적용하였다. 그레이 이론은 주로 다중 입력, 불완전 또는 불확실한 정보에 적용하고 5개의 단계를 통해서 산출한다. 첫번째로 각 오류의 빈도, 중증도, 발견가능성의 정규행렬로 가중 평균을 산출하고, m개의 기준이 있는 n개의 데이터 시퀀스(sequence)를 만든다. 두번째로 데이터 집합을 정규화하고, 다음 방정식에 따라 참고 시퀀스를 생성한다. 이때 정규화된 데이터는 오류의 빈도, 중증도, 발견가능성에서 최대값과 현재값의 차이를 최대값과 최소값의 차이로 나눈 것이다.
세번째는 정규화된 값과 참고값 사이의 차이를 계산하여 절대값 테이블을 생성한다.
네번째는 다음 방정식을 이용하여 그레이 관계 계수를 계산한다.
마지막으로 상관관계 또는 유사성의 크기를 나타내는 그레이 관계등급(grey relational grade, GRG)을 계산한다. 그레이 관계등급은 다음 방정식을 사용하여 그레이 관계 계수의 평균값을 취함으로써 계산한다.
관계등급의 수가 작을수록 높은 위험도 우선순위를 의미하고, 관계등급이 1에 가까울수록 오류유형이 최적의 조건에 가까운 것을 의미한다.
4. 평가항목
오류유형 및 영향분석을 통해 산출된 위험도 우선순위와 그레이 관계분석을 통해 산출된 그레이 관계등급을 산출하고, 직접염기서열분석과 NGS 검사에서 위험도의 순서를 직접 비교 분석한다.
결 과
1. 직접염기서열분석에 대한 위험도 분석
오류유형 및 영향분석에서 중증도는 2-8까지 분포되어 있고, 빈도는 주로 1을 보이지만 두가지 과정에서 2를 나타냈다(
Table 1). 발견가능성은 2-6의 분포를 보여 위험도 우선순위값은 4-72까지의 분포를 보인다. 그레이 관계분석에서는 중증도는 0.34-0.99, 빈도는 0.52-0.93, 발견가능성은 0.40-1.00까지의 분포를 보였으며 그레이 관계분석에서 관계등급은 0.44-0.76까지의 분포를 보였다.
2. NGS에 대한 위험도 분석
오류유형 및 영향분석에서 중증도는 3-8까지 분포되어 있고, 빈도는 주로 1을 보이지만 두가지 과정에서 2를 나타냈다(
Table 2). 발견가능성은 3-6의 분포를 보여 위험도 우선순위값은 12-102까지의 분포를 보인다. 그레이 관계분석에서는 중증도는 0.34-0.91, 빈도는 0.70-1.00, 발견가능성은 0.41-0.90까지의 분포를 보였으며 그레이 관계분석에서 관계등급은 0.51-0.90까지의 분포를 보였다.
3. 위험도 비교
전체 검사 과정은 직접염기서열분석이 25단계이고, NGS 검사는 44단계로 더 많은 단계가 필요하고, 전체 위험도 우선순위값도 465인 직접염기서열분석에 비해 1,103으로 NGS 검사가 더 높은 위험도를 나타내고 있다(
Table 3). 직접염기서열분석에서는 PCR 튜브에 DNA 첨가, 플레이트(plate)에 PCR 산물 첨가, 결과 해석 및 결과 입력 단계에서 오류유형 및 영향분석과 그레이 관계 분석 모두에서 높은 위험도를 보였다. NGS 검사에서는 반응 혼합액(reaction mix)에 DNA 첨가 및 결과 해석 단계가 오류유형 및 영향분석과 그레이 관계 분석에서 공통적으로 높은 위험도를 보였다.
고 찰
본 연구에서는 고해상도 HLA 형별 검사인 직접염기서열분석과 NGS 검사에 대한 위험도 평가를 진행하였다. 연구 결과는 NGS의 검사 단계가 더욱 많아 전체 위험도 우선순위값이 높게 나타났다. 직접염기서열분석에서는 PCR 튜브에 DNA 첨가, 플레이트(plate)에 PCR 산물 첨가, 결과해석 및 결과 입력 단계에서 위험도에 대한 검토 및 고찰이 필요하고, NGS 검사에 대해서는 반응 혼합액(reaction mix)에 DNA 첨가 및 결과 해석에 대한 검토 및 고찰이 필요하다.
진단검사의학과 검사실은 환자 치료, 진단, 치료 후 모니터링 및 예후 예측과 관련된 많은 검사를 시행하고 있다. 검사실에서의 검사 방법은 매우 복잡한 과정으로 이루어져 있고, 그 과정 중 어느 단계에서나 오류가 발생할 수 있다. 발생한 오류는 매우 낮은 위험에서부터 매우 높은 위험까지 다양하고, 빈번하고 결과에 미치는 영향이 크며, 발견하기 어려울수록 위험도는 상승한다[
11,
12]. 검사실 관리자는 임상적으로 수용할 수 있는 정도의 위험도를 유지하도록 관리가 요구된다. 따라서 신뢰할 수 있고 정확한 결과를 산출하기 위해 발생 가능한 위험도를 확인하고 이를 개선하는 과정을 검토하는 것이 전체 검사 과정에 반드시 포함이 되어야 한다. 질 관리 프로그램(Quality Assurance Programs)은 발생가능한 위험도를 확인하여 체계적인 검토를 가능케 한다[
17]. 2017년부터 진단검사의학재단에서는 우수검사실 신임인증 검사실운영 분야 심사점검표에 위험관리 관련 항목을 추가하여 검사실에서의 위험도 관리에 대한 중요성을 적용하고 있다.
CLSI EP18A2에서는 오류유형 및 영향분석을 통해 발생가능한 위험도를 확인하고, 시스템에 어떠한 결과를 야기하는지 결정할 수 있도록 하였다[
11]. 오류유형 및 영향분석은 상향식(bottom-up) 접근으로써 이미 구축된 단계에 대한 고찰이 가능하다. 따라서 임상 검사실에서는 새로운 검사법이나 장기 도입에 앞서 오류유형 및 영향 분석을 통해 발생가능한 검사실 특이 위험도를 확인하고 예방 가능한 대처법을 고안할 수 있다[
17]. 본 연구에서 HLA 형별 확인을 위해 검사하는 고해상도 검사인 직접염기서열분석과 NGS 검사에 대하여 위험도를 비교하고 분석하였을 때 검사 단계가 많은 NGS의 위험도 우선순위값이 높게 나타났다(직접염기서열분석 vs. NGS, 단계: 25 vs. 44; 위험도 우선순위값: 465 vs. 1,103). 그러나 오류유형 및 영향 분석이 갖는 세가지 한계가 있다. 첫번째는 각각의 검사 과정에서 개입 필요성이 있는 단계의 위험도 컷오프(cutoff) 수치가 명확하게 표준화되거나 검증되어 있지 않고, 위험도 고찰의 우선순위만을 정해준다[
18]. 다만. 이전 연구에서는 위험도 우선순위값이 300 이상일 때 개입이 필요하다고 보고하기도 하였는데[
19], 본 연구 결과에서는 300 이상을 나타내는 단계는 존재하지 않았다. 두번째로 본 연구는 평가자의 주관적인 요소를 배제하고 객관적 지표에 대한 적용을 위해 여러 방안을 도입하였지만, 단일 기관에서 평가하였다는 한계가 존재한다. 따라서, 보다 많은 기관 및 평가자가 참여한 대규모 연구를 시행한다면 심도있고 다중적 결론을 도출할 수 있을 것이다. 세번째는 여러 전문가가 팀을 이루어 평가를 하는 과정으로써 팀이 확인하지 못하고 고려하지 않으면 에러 발생이 배제될 수 있고, 전문가의 평가에 따라 결과의 중복으로 결과에 영향을 미쳐 위험도의 가중법칙(weighted rule)을 적용할 수가 없다[
16]. 이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구에서는 오류유형 및 영향 분석과 함께 그레이 관계분석을 시행하였다. 그레이 관계분석은 정량적 분석 도구로써 부정확하고 미완의 정보를 조합하여 산술적 식을 통해 유사성을 분석하는 것으로써 위험도 우선순위값에 중복을 줄이고 가중법칙을 적용할 수 있는 장점을 가지고 있다[
16]. 오류유형 및 영향 분석과 그레이 관계 분석을 통해 직접염기서열분석에서는 PCR 튜브에 DNA 첨가, 플레이트(plate)에 PCR 산물 첨가, 결과 해석 및 결과 입력 단계에서의 위험도 고찰이 필요하고, NGS 검사에서는 반응 혼합액(reaction mix)에 DNA 첨가 및 결과 해석 단계의 재확인이 필요함을 객관적 방법으로 증명하였다. 공통적으로 튜브나 플레이트에 첨가하는 과정과 결과 해석 및 입력의 오류 가능성이 높으므로 이를 개선하기 위한 절차의 고찰이 필요하다.
그러나, 본 연구의 제한점은 검사 과정에서 발생 가능한 위험도를 예측하기 위해 산술적 통계 방식을 이용하였기 때문에 실제 오류 발생 가능성과의 차이가 발생할 수 있다. 오류유형 및 영향 분석에서 위험도 우선순위값 요소(중증도, 빈도, 발견가능성)는 중복된 숫자의 발생이 가능하고, 그레이 관계분석은 오류의 발생과 오류발생 원인 간의 직접적 및 간접적 상관관계를 고려하지 않으므로 위험도 우선순위값과 그레이 관계분석에서 제시하는 순위는 실제 현장에서의 요구와 상이할 가능성도 배제할 수 없다.
본 연구는 HLA 형별 확인을 위해 시행하는 직접염기서열분석과 NGS 검사에 대한 위험도 평가를 위해 오류유형 및 영향 분석과 그레이 관계 분석을 적용한 첫번째 연구이다. NGS 검사는 직접염기 서열분석보다 많은 검사단계로 높은 위험도를 보인다. 그리고 튜브나 플레이트에 첨가하는 과정과 결과 해석 및 입력의 오류의 가능성이 높으므로 업무흐름(workflow)의 개선이나 자동화 도입을 통해 노력의 필요성이 있다.
감사의 글
본 논문은 2022년 대한진단면역학회 학술연구 사업의 결과입니다.
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23002928.
Table 1
Risk assessment by FMEA in direct sequencing
|
Processing step |
FMEA |
GRG |
|
S |
O |
D |
RPN |
Rank |
S |
O |
D |
GRG |
Rank |
|
1. Add PCR mixture to PCR tubes |
4 |
1 |
5 |
20 |
8 |
0.80 |
0.52 |
0.59 |
0.63 |
11 |
|
2. Add extracted DNA to PCR tubes |
8 |
1 |
5 |
44 |
4 |
0.34 |
0.52 |
0.46 |
0.44 |
1 |
|
3. Run in PCR system |
4 |
1 |
3 |
10 |
17 |
0.81 |
0.52 |
0.92 |
0.75 |
24 |
|
Gel electrophoresis |
|
4. Add PCR product to agarose gel |
2 |
1 |
4 |
12 |
13 |
0.59 |
0.73 |
0.61 |
0.64 |
12 |
|
5. Electrophoresis |
3 |
1 |
2 |
5 |
19 |
0.84 |
0.52 |
0.76 |
0.71 |
20 |
|
6. Interpret the bands with an analyzer |
3 |
1 |
2 |
5 |
20 |
0.99 |
0.52 |
0.65 |
0.72 |
22 |
|
PCR product clean-up |
|
7. Add clean solution and run in the PCR system |
4 |
1 |
4 |
18 |
9 |
0.79 |
0.52 |
0.59 |
0.63 |
9 |
|
Sequencing reaction |
|
8. Dilute the PCR products |
4 |
1 |
5 |
26 |
6 |
0.82 |
0.73 |
0.54 |
0.70 |
19 |
|
9. Add primer and dye mixture to a plate |
6 |
2 |
5 |
48 |
2 |
0.56 |
0.93 |
0.52 |
0.67 |
16 |
|
10. Add diluted PCR products to plate |
7 |
2 |
5 |
72 |
1 |
0.40 |
0.66 |
0.52 |
0.52 |
4 |
|
11. Run in PCR system |
4 |
1 |
2 |
10 |
18 |
0.76 |
0.52 |
1.00 |
0.76 |
25 |
|
Purification for dye removal |
|
12. Add sodium acetate/EDTA buffer |
3 |
1 |
5 |
21 |
7 |
0.91 |
0.73 |
0.54 |
0.73 |
23 |
|
13. Add ethanol to the plate |
3 |
1 |
5 |
13 |
12 |
0.84 |
0.52 |
0.54 |
0.63 |
10 |
|
14. Centrifuge (30 min at 2,000 g) |
3 |
1 |
1 |
3 |
24 |
0.81 |
0.52 |
0.52 |
0.62 |
7 |
|
15. Invert onto a paper towel and remove supernatant |
2 |
1 |
5 |
11 |
15 |
0.69 |
0.52 |
0.56 |
0.59 |
5 |
|
16. Add 80% ethanol |
3 |
1 |
4 |
12 |
14 |
0.90 |
0.52 |
0.60 |
0.67 |
17 |
|
17. Centrifuge (5 min at 2,000 g) |
3 |
1 |
1 |
3 |
24 |
0.81 |
0.52 |
0.52 |
0.62 |
74 |
|
18. Invert onto a paper towel and remove supernatant |
2 |
1 |
5 |
11 |
15 |
0.69 |
0.52 |
0.56 |
0.59 |
5 |
|
19. Dry 3 min at 65˚C |
2 |
1 |
2 |
5 |
21 |
0.67 |
0.52 |
0.87 |
0.69 |
18 |
|
20. Add high-deionized formamide |
4 |
1 |
4 |
16 |
10 |
0.82 |
0.52 |
0.60 |
0.65 |
13 |
|
21. Dry 3 min at 95˚C |
2 |
1 |
2 |
4 |
23 |
0.61 |
0.52 |
0.87 |
0.66 |
14 |
|
22. Incubate for 3 min at 0˚C |
2 |
1 |
2 |
4 |
22 |
0.61 |
0.52 |
1.00 |
0.71 |
21 |
|
23. Run in genetic analyzer |
5 |
1 |
3 |
14 |
11 |
0.56 |
0.52 |
0.92 |
0.67 |
15 |
|
Interpretation and report |
|
24. Interpret the results |
6 |
1 |
6 |
45 |
3 |
0.50 |
0.61 |
0.40 |
0.50 |
2 |
|
25. Input the result on LIS manually |
5 |
1 |
6 |
33 |
5 |
0.58 |
0.52 |
0.41 |
0.50 |
3 |
Table 2
Risk assessment by FMEA in NGS
|
Processing step |
FMEA |
GRG |
|
S |
O |
D |
RPN |
Rank |
S |
O |
D |
GRG |
Rank |
|
Amplification |
|
1. Add nuclease-free water to the PCR tube |
4 |
1 |
4 |
15 |
37 |
0.80 |
0.70 |
0.78 |
0.76 |
41 |
|
2. Add polymerase, buffer, and dNTPs |
5 |
1 |
5 |
23 |
20 |
0.65 |
0.70 |
0.50 |
0.62 |
15 |
|
3. Identify and add primer pellet |
5 |
2 |
5 |
44 |
3 |
0.55 |
0.97 |
0.50 |
0.67 |
25 |
|
4. Add extracted DNA to the reaction mix |
8 |
1 |
5 |
42 |
4 |
0.34 |
0.70 |
0.50 |
0.51 |
1 |
|
5. Run in PCR system |
5 |
1 |
3 |
13 |
39 |
0.59 |
0.70 |
0.90 |
0.73 |
34 |
|
DNA quantification |
|
6. Add Qubit reagent to Qubit tube |
4 |
1 |
5 |
18 |
32 |
0.79 |
0.70 |
0.50 |
0.66 |
21 |
|
7. Add Qubit buffer to Qubit tube |
4 |
1 |
5 |
18 |
32 |
0.79 |
0.70 |
0.50 |
0.66 |
21 |
|
8. Add DNA to the Qubit tube |
3 |
1 |
5 |
17 |
34 |
0.90 |
0.70 |
0.50 |
0.70 |
29 |
|
9. Measure amplicons conc. at fluorometer |
4 |
2 |
3 |
20 |
27 |
0.79 |
0.97 |
0.62 |
0.79 |
43 |
|
10. Calculate the required volume of each gene and pool amplicons |
4 |
2 |
5 |
36 |
8 |
0.72 |
0.97 |
0.44 |
0.71 |
31 |
|
Fragmentation and adapter ligation |
|
11. Prepare fragmentation master mix |
4 |
1 |
5 |
20 |
28 |
0.80 |
0.70 |
0.50 |
0.67 |
23 |
|
12. Add master mix to plate well |
5 |
1 |
5 |
25 |
17 |
0.59 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
9 |
|
13. Add amplicon to plate well |
5 |
1 |
5 |
27 |
13 |
0.59 |
0.70 |
0.44 |
0.58 |
5 |
|
14. Run in a PCR system |
4 |
1 |
3 |
12 |
44 |
0.65 |
0.70 |
0.90 |
0.75 |
39 |
|
15. Prepare adaptor ligation master mix |
5 |
1 |
5 |
27 |
13 |
0.55 |
0.70 |
0.50 |
0.58 |
7 |
|
16. Add ligation master mix to DNA fragmentation |
5 |
1 |
5 |
25 |
17 |
0.59 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
9 |
|
17. Incubation in the PCR system |
5 |
1 |
3 |
13 |
39 |
0.59 |
0.70 |
0.90 |
0.73 |
34 |
|
DNA clean-up |
|
18. Add magnetic beads and incubate for 5 min |
4 |
1 |
5 |
22 |
25 |
0.65 |
0.70 |
0.50 |
0.62 |
16 |
|
19. Place the plate on a magnetic stand and remove supernatant |
4 |
2 |
3 |
16 |
36 |
0.81 |
1.00 |
0.90 |
0.90 |
44 |
|
20. *Add 80% ethanol, incubate for 30 sec, and remove the supernatant |
4 |
2 |
5 |
102 |
9 |
0.65 |
1.00 |
0.57 |
0.74 |
38 |
|
21. Remove ethanol and dry for 3–5 min |
4 |
2 |
5 |
40 |
5 |
0.81 |
0.66 |
0.57 |
0.68 |
26 |
|
22. Add the elution buffer and incubate for 2 min at RT on shaker |
4 |
1 |
3 |
13 |
42 |
0.65 |
0.70 |
0.74 |
0.70 |
28 |
|
23. Place the plate on a magnetic stand and transfer the eluate to a new plate |
4 |
1 |
5 |
20 |
31 |
0.81 |
0.70 |
0.44 |
0.65 |
20 |
|
Indexing PCR |
|
24. Prepare (thaw and centrifuge) for reagent |
4 |
1 |
5 |
20 |
28 |
0.80 |
0.70 |
0.50 |
0.67 |
23 |
|
25. Add HiFi PCR Mix to the IndX plate |
5 |
1 |
5 |
27 |
13 |
0.57 |
0.70 |
0.50 |
0.59 |
8 |
|
26. Add eluate to IndX plate |
5 |
1 |
5 |
28 |
12 |
0.57 |
0.70 |
0.44 |
0.57 |
4 |
|
27. Incubation in PCR system |
5 |
1 |
3 |
13 |
39 |
0.59 |
0.70 |
0.90 |
0.73 |
34 |
|
28. Transfer DNA to a new tube and mix |
5 |
1 |
5 |
25 |
19 |
0.60 |
0.70 |
0.44 |
0.58 |
6 |
|
29. Add magnetic beads and incubate for 5 min |
5 |
1 |
5 |
23 |
20 |
0.60 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
11 |
|
30. Place the plate on a magnetic stand and remove the supernatant |
4 |
2 |
5 |
31 |
10 |
0.73 |
1.00 |
0.57 |
0.76 |
42 |
|
31. Add 80% ethanol, incubate for 30 sec, and remove the supernatant |
5 |
2 |
5 |
36 |
6 |
0.60 |
1.00 |
0.57 |
0.72 |
32 |
|
32. Remove ethanol and dry for 3–5 min |
4 |
2 |
5 |
31 |
10 |
0.73 |
0.97 |
0.57 |
0.75 |
40 |
|
33. Add the elution buffer and incubate for 2 min at RT on shaker |
5 |
1 |
3 |
14 |
38 |
0.60 |
0.70 |
0.74 |
0.68 |
27 |
|
34. Place the plate on a magnetic stand and transfer eluate to a new tube |
4 |
1 |
5 |
21 |
26 |
0.73 |
0.70 |
0.44 |
0.63 |
17 |
|
Library quantification |
|
35. Prepare the Qubit working solution with the library sample |
5 |
1 |
5 |
23 |
20 |
0.60 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
11 |
|
36. Measure library conc. at a fluorometer and calculate the Qubit results to nanomolar concentration. |
5 |
2 |
3 |
26 |
16 |
0.59 |
0.97 |
0.62 |
0.73 |
33 |
|
Next generation sequencing |
|
37. Thaw and wash the reagent |
4 |
1 |
5 |
20 |
28 |
0.73 |
0.70 |
0.50 |
0.64 |
19 |
|
38. Dilute library to a conc. of 4 nM |
6 |
2 |
5 |
50 |
2 |
0.50 |
0.97 |
0.44 |
0.64 |
18 |
|
39. Add 0.2 N NaOH |
5 |
1 |
5 |
23 |
20 |
0.60 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
11 |
|
40. Incubate the tube |
3 |
1 |
5 |
17 |
34 |
0.91 |
0.70 |
0.50 |
0.70 |
30 |
|
41. Add the HT1 buffer |
5 |
1 |
5 |
23 |
20 |
0.60 |
0.70 |
0.50 |
0.60 |
11 |
|
42. Run paired-end sequencing in the Miseq analyzer Interpretation and report |
5 |
1 |
3 |
12 |
43 |
0.60 |
0.70 |
0.90 |
0.73 |
37 |
|
43. Interpret the results |
7 |
1 |
6 |
62 |
1 |
0.39 |
0.86 |
0.41 |
0.55 |
3 |
|
44. Input the result on LIS manually |
6 |
1 |
6 |
36 |
7 |
0.53 |
0.70 |
0.41 |
0.55 |
2 |
Table 3
Comparison of risk priority between direct sequencing (SBT) and NGS for HLA typing
|
SBT |
NGS |
|
Total steps |
25 |
44 |
|
Total RPN |
465 |
1,103 |
|
FMEA |
|
1st RPN |
Add diluted PCR products to a plate |
Interpret the results |
|
2nd RPN |
Add primer and dye mixture to a plate |
Dilute library to a concentration of 4 nM |
|
3rd RPN |
Interpret the results |
Identify and add the primer pellet |
|
4th RPN |
Add extracted DNA to the PCR tubes |
Add extracted DNA to the reaction mix |
|
5th RPN |
Input the result on LIS manually |
Remove ethanol and dry for 3–5 min |
|
GRG |
|
1st GRG |
Add extracted DNA to PCR tubes |
Add the extracted DNA to the reaction mix |
|
2nd GRG |
Interpret the results |
Input the result on LIS manually |
|
3rd GRG |
Input the result on LIS manually |
Interpret the results |
|
4th GRG |
Add diluted PCR products to a plate |
Add eluate to the IndX plate |
|
5th GRG |
Invert onto a paper towel and remove the supernatant |
Add amplicon to a plate well |
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